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第一部分 肺炎衣原体感染小鼠模型的建立
目的
建立肺炎衣原体感染小鼠模型,研究肺炎衣原体感染引起小鼠肺部及其他相关脏器的病理学改变,初步探讨其发病机制。
方法
通过鼻内接种和静脉接种方法建立肺炎衣原体感染小鼠模型。采用艇染色观察肺部病理改变,以PCR、MIF、电镜、免疫组织化学染色以及原位杂交等方法,证实接种小鼠感染肺炎衣原体,并确定肺炎衣原体的易感部位和特定细胞。
结果
以MIF法检测感染小鼠血清,鼻内接种(NT)组最早于第7天发现肺炎衣原体特异性IgG抗体,此后抗体滴度迅速增加,于第21天时达峰值,几何平均滴度(GMT)为1∶181,并维持至第60天。静脉接种(VT)组IgG抗体有类似改变,但出现更早。NT组和VT组小鼠在实验前14天内,肺组织PCR检测到肺炎衣原体DNA。病理改变主要表现为不均匀分布的间质性及局灶性肺炎,以第3~7d最为明显,包括肺泡壁充血,伴有嗜中性粒细胞浸润,肺泡腔内以及支气管周围有大量炎性细胞渗出,早期大量嗜中性粒细胞浸润,后期则淋巴细胞、单核巨噬细胞浸润为主。鼻内接种组肺炎明显重于静脉接种组。光镜下心、肝、脾未见异常。电镜可见NT组小鼠肺泡上皮细胞内各个发育阶段肺炎衣原体(如网质体、中间体和原体)所形成的包涵体,吞噬细胞胞浆内可见较多包涵体,大部分已被分解出现空泡化。免疫组化法、原位杂交法观察到肺炎衣原体的阳性表达,主要分布于在肺泡巨噬细胞、细支气管管腔上皮细胞、肺泡上皮细胞、间质细胞及支气管周围淋巴组织中。 结论
成功建立肺炎衣原体感染小鼠模型,鼻内接种途径可能更佳。肺可能是肺炎衣原体特异性的靶器官,肺炎衣原体从肺脏播散到其他器官最可能途径是通过感染的淋巴细胞和巨噬细胞。
第二部分 肺炎衣原体感染对小鼠免疫状态影响的初步研究
目的
通过检测鼻内接种组小鼠Th1/Th2平衡改变,对感染后小鼠机体免疫状态进行初步研究,为探讨肺炎衣原体感染的免疫学特点和免疫应答机制奠定基础。
方法
96只小鼠随机分为实验组和对照组,采用鼻内接种途径建立肺炎衣原体感染小鼠模型。观察记录肺组织病理和电镜改变。ELISA法检测血清中IL-4和IFN-γ表达。流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞中Th1和Th2细胞,计算Th1/Th2。
结果
肺炎衣原体感染的肺组织病理表现多为局灶性肺炎,3~7天最为明显,常伴灶性或片状实变,中性粒细胞含量较多。14天后单核细胞和淋巴细胞含量增多,并伴不同程度纤维母细胞增生。鼻内接种肺炎衣原体后24小时,可见IL-4水平开始升高,第3天时浓度达到最高(24.38±2.52pg/ml)。持续至第7天,而后恢复到基线水平。与对照组相比,实验组在接种肺炎衣原体后第1天、第3天和第5天,小鼠血清IL-4明显升高,p<0.01。IFN-γ在接种后24小时即达到峰值(23.00±5.15pg/ml),此后浓度逐渐下降。与对照组相比,接种肺炎衣原体后第1、3、5和7天,小鼠血清IFN-γ明显升高,p<0.01。采用CD3+CD8-T淋巴细胞为Th细胞,设门分析Th1细胞(IFN-γ+)和Th2细胞(IL-4+)百分比。对照组小鼠Th细胞功能上以Th1细胞占优势,接种肺炎衣原体后Th1/Th2比值明显降低,细胞分类向Th2细胞漂移。第3天时,Th1/Th2比值降到最低值。实验组小鼠在感染后所检测42天内,所有Th1/Th2比值均明显低于对照组,p<0.01。
结论
小鼠感染肺炎衣原体后,细胞分类向Th2细胞漂移。宿主肺部炎症病变加重与早期Th1胞免疫活性受到抑制有关。与外周血IFN-γ/IL-4比值相比,流式技术检测细胞内IFN-γ/IL-4,更能代表Th1/Th2极化状态。