本研究建立了猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法,通过不同传播途径建立小鼠感染模型,并对通过腹腔注射建立的模型进行了病理组织学研究,主要工作如下:一、猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法的建立及应用将通过水浴-过滤法分离纯化的具有较强感染力的附红细胞体,按常规程序免疫家兔与小鼠,得到高效价的阳性血清。并通过反应条件的优化(捕获抗体1:200稀释,4℃包被过夜,1 %明胶溶液37℃封闭1 h,检测抗体1:400稀释,37℃作用2 h,酶标二抗1:8000稀释,37℃作用1 h,37℃显色10 min)及敏感性(最低检出量为3.812μg/ml)、特异性、重复性实验(组间、组内的变异系数分别为6. 57 %、4.58 %)的验证,建立了稳定的双抗夹心ELISA检测方法。对上海地区采集的91份猪血样的临床检测中,本试验建立的双抗夹心ELISA方法,检出阳性率为53.8 %;略低于PCR检测结果阳性率57.1 %,高于瑞氏-姬姆萨染色镜检法(34.1 %)。说明本方法具有较高的可行性,且操作简便,为诊断试剂盒的研制奠定了基础,适用于基层大规模检测。二、猪附红细胞体传播途径的初步研究本实验利用SPF昆明小鼠作为模型动物,将从阳性猪血中分离纯化的附红细胞体,以腹腔注射方式感染小鼠,以健康猪血分离物注射小鼠作为阴性对照,同时设立了饮水组(在小鼠日常饮水中加入纯化的附红细胞体)、接触组(小鼠本身未做处理,但与攻毒组同笼饲养)及空白组(小鼠未作任何处理),欲对其传播途径进行初步的研究。采集小鼠血液,应用显微镜检、PCR及双抗夹心ELISA法对附红细胞体体内感染消长时间及分布情况进行检测。镜检表明,附红细胞体感染的首现期为注射后第1 d,第5 d感染率达到高峰(80 %左右),随后逐渐降低。在整个实验过程中,腹腔注射组小鼠红细胞变形严重,PCR和双抗夹心ELISA检测始终为阳性。而其他各组小鼠红细胞未见明显变形,且PCR和双抗夹心ELISA检测均为阴性。表明该病原不易通过口腔、胃肠道黏膜及空气,呼吸分泌物,唾液等传播,为进一步研究其传播途径鉴定了基础。三、猪附红细胞体小鼠病理模型的建立在确定附红细胞体能通过腹腔注射感染小鼠的基础上,研究感染后临床症状、剖检、组织病理变化,为进一步揭示猪附红细胞体的致病机理奠定基础,为其诊断提供一种手段。研究结果显示感染组小鼠没有表现出明显的特征性临床症状,但相对于对照组小鼠出现了精神萎靡,食欲不振,呼吸急促等现象。组织石蜡切片表明心、肝、脾、肺、肾脏出现了不同程度的病变,而十二指肠未见明显变化。对照组小鼠的内脏器官则均未出现明显病理变化。组织冰冻切片免疫荧光结果显示,荧光颗粒均未附着在组织上,而是散在分布于组织间隙中。表明附红细胞体的靶细胞只有红细胞,为该病的病理学研究打下一定的基础。