【摘 要】
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Ⅱ-型糖尿病（Type two diabetes mellitus,T2DM）的发病率逐年上升,已经严重危害人体健康。研究表明,食物蛋白肽与运动均在T2DM的预防与治疗中发挥着重要作用。此外,胰高血糖素样肽-1（Glucagon like peptide-1,GLP-1）能调节胰岛素和胰高血糖素的分泌,但它极易被二肽基肽酶-Ⅳ（Dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ）降解失去活性
【基金项目】
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“蓝色粮仓”国家重点研发计划项目（2018YFD0901004）；
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Ⅱ-型糖尿病（Type two diabetes mellitus,T2DM）的发病率逐年上升,已经严重危害人体健康。研究表明,食物蛋白肽与运动均在T2DM的预防与治疗中发挥着重要作用。此外,胰高血糖素样肽-1（Glucagon like peptide-1,GLP-1）能调节胰岛素和胰高血糖素的分泌,但它极易被二肽基肽酶-Ⅳ（Dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ）降解失去活性,故有效抑制DPP-Ⅳ,提高GLP-1的水平是预防和治疗T2DM的重要手段。本论文旨在基于动物水平评价坛紫菜DPP-Ⅳ抑制肽和运动介导GLP-1的血糖调节功能。本研究从牛肾皮质中分离纯化DPP-Ⅳ,并以DPP-Ⅳ作为工具酶,以坛紫菜为原料制备DPP-Ⅳ抑制肽,之后探究坛紫菜DPP-Ⅳ抑制肽和（或）运动对高脂高糖饮食小鼠的影响。通过酸沉淀、硫酸铵盐析和凝胶过滤层析纯化得到高纯度DPP-Ⅳ,结果显示,还原条件下,纯化蛋白的分子量为106 k Da,纯化倍数为169.9,得率为9.5%。对该蛋白进行质谱鉴定发现其与牛DPP-Ⅳ氨基酸序列的匹配度为100%。对其性质研究发现,DPP-Ⅳ为糖蛋白且以二聚体形式（210 k Da）存在,等电点为5.8。圆二色谱结果表明,DPP-Ⅳ二级结构具有典型的β-折叠构象,热变性温度为72.7±0.3℃。DPP-Ⅳ具有较好的热稳定性与p H稳定性,金属离子Zn2+、Fe2+及Fe3+对DPP-Ⅳ的酶活力有明显的抑制作用,其中1 mmol/L的Zn2+对DPP-Ⅳ的酶活力抑制率高达98%。以DPP-Ⅳ作为工具酶,以坛紫菜为原料制备DPP-Ⅳ抑制肽。首先进行粗蛋白的提取,之后选用消化酶分两步进行酶解条件的优化。结果显示,在胃蛋白酶加酶量为0.1%,酶解时间为30 min,胰蛋白酶+胰凝乳蛋白酶的加酶量为0.6%,酶解时间为15 min时,酶解产物显示出最高的DPP-Ⅳ抑制率,为82.2%。酶解产物对DPP-Ⅳ的IC50值为0.16 mg/m L,显示出较好的体外DPP-Ⅳ抑制活性。进一步探究坛紫菜DPP-Ⅳ抑制肽及运动对高脂高糖饮食小鼠的影响。6周龄的C57BL/6J小鼠随机分为正常饮食组（CON组）、高脂高糖饮食组（HSHF组）、高脂高糖饮食+DPP-Ⅳ抑制肽组（HSHF+P组）、高脂高糖饮食+运动组（HSHF+E组）、高脂高糖饮食+DPP-Ⅳ抑制肽+运动组（HSHF+P+E组）。普通饮食组小鼠给予标准饲料,高脂高糖饮食小鼠给予高脂高糖饲料。干预8周,在此期间,紫菜DPP-Ⅳ抑制肽干预组进行肽粉的灌胃,运动组进行中等强度有氧运动,CON组作为正常对照组不做处理,HSHF组作为实验对照组灌胃等体积灭菌水。每周进行体重、摄食量和空腹血糖（Fasting blood glucose,FBG）的测定。干预结束后,检测小鼠的体重、FBG、口服葡萄糖耐量（Oral glucose tolerance test,OGTT）、脂肪组织重量,收集血液,进行血清胰岛素、血清糖化血红蛋白（Glycated hemoglobin,Hb A1c）、血脂四项、血清DPP-Ⅳ活性的检测,q-PCR检测DPP-Ⅳ（小肠、肝脏）和GLP-1（小肠）的m RNA表达变化。结果显示,（1）高脂高糖饮食会导致小鼠体重和FBG升高、糖耐量受损、Hb A1c水平显著升高、白色脂肪增多、高密度脂蛋白（High density lipoprotein,HDL-C）水平显著降低,DPP-Ⅳ抑制肽和运动均能显著改善以上指标,且能降低甘油三酯（Triglyceride,TG）、总胆固醇（Total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL-C）的水平,运动及两种方式联合的效果相较于DPP-Ⅳ抑制肽更好;（2）高脂高糖饮食会导致小鼠血清DPP-Ⅳ活性升高、小肠和肝脏DPP-Ⅳ基因表达量显著升高、小肠GLP-1的基因表达量显著降低,DPP-Ⅳ抑制肽和（或）运动均可以显著抑制高脂高糖饮食小鼠的血清DPP-Ⅳ活性、降低DPP-Ⅳ基因表达量、增强GLP-1的基因表达量。其中,运动干预能更大程度上抑制DPP-Ⅳ的活性,DPP-Ⅳ抑制肽对于DPP-Ⅳ基因表达的抑制效果相较于运动更好,对于GLP-1基因表达的增强作用,两种干预方式结合似乎是一种更好的手段。
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