研究背景近年来,随着国内牙周医学的快速发展,越来越多的口腔医生并始关注牙周疾病,尤其是发病率极高的慢性牙周炎。美国人慢性牙周炎的发病率约47.6%,中国人群其发病率更高。众所周知,慢性牙周炎是菌斑微生物引起的慢性非特异性炎症性疾病,以造成牙周组织破坏、牙槽骨吸收和病理性牙周袋的行为为特征。牙周炎是一种炎症性疾病,但是我们不能再将其看作是一种局限于局部炎症,它可能通过增加机体全身炎症负担和增强机体免疫反应的途径来影响全身其它系统。目前,有大量研究证明了牙周炎和全身各系统的疾病相关联。其中它与2型糖尿病(type2diabetes mellitus T2DM)的研究引起极大关注。T2DM是一种危害极大、发病率极高的慢性病。随着老龄化的进程,糖尿病合并牙周炎的患者急剧增加。现已证明,牙周炎与T2DM互为对方的独立危险因素。慢性牙周炎可加重机体全身炎症状态,升高全身炎症因子水平,促进胰岛素抵抗,不利于血糖控制,进而影响T2DM及其并发症的发生和发展。而T2DM时,机体对炎症的免疫力增强,牙周组织局部分泌过多的炎性细胞、炎性因子和蛋白酶,使得局部组织的破坏增加,加重牙周炎症程度。而2型糖尿病其最大的危害在于其远期的慢性并发症,其中之一糖尿病肾病(Diabetic Kidney Disease DKD)是糖尿病患者的主要死亡原因之一。DKD的主要病理改变为肾脏细胞外基质-Ⅳ型胶原(胶原)的过度蓄积,产生肾小球硬化和肾间质纤维化。导致产生以上病变的机制复杂,但涉及几个关键的细胞因子和蛋白酶：转化生长因子β1(transforming growth factor--β1TGF-β1)在肾间质纤维化和肾小球硬化中起着关键作用；基质金属蛋白酶系统中MMP-2(明胶酶A),MMP-9(明胶酶B)以及抑制因子TIMP-1是研究发现主要调节肾脏细胞外基质(extracellular matrix ECM)平衡的关键因子。目前对于牙周炎对T2DM的慢性并发症DKD影响的研究非常少,且多为临床病例的观察。因此本研究拟采用应用价值极高,且与人类T2DM发病极其相似的自发型2型糖尿病动物模型OLETF大鼠,在其上复合慢性牙周炎建立两种疾病复合动物模型的方法,排除其他混杂因素的干扰,初步探讨牙周炎对T2DM发生发展的作用。分析T2DM时牙周炎是否会对肾脏功能和肾脏组织结构产生影响。并通过检测与DKD发生密切相关的Ⅳ型胶原、TGF-β1、MMP-2, MMP-9, TIMP-1蛋白表达和基因转录水平的差异,进一步分析牙周炎对T2DM大鼠肾脏病损是否存在影响及其影响的病理机制,为进一步研究牙周炎与T2DM及DKD的相互关系建立可靠的实验基础,为临床多学科联合诊断,治疗和预防提供证据。第一章OLETF大鼠慢性牙周炎模型的建立目的在OLETF大鼠到达糖耐量受损期时,通过牙周局部丝线结扎联合牙周局部涂菌建立糖尿病复合牙周炎模型,为下一步研究牙周炎对T2DM大鼠肾脏功能及肾脏病损是否存在影响及其影响的病理机制奠定基础。方法(1)自发性2型糖尿病OLETF大鼠(O组),4周龄,雄性,30只；同种系同周龄糖耐量正常的LETO大鼠(L组),雄性,20只。每4周行一次口服糖耐量检测,按2g/kg予50%葡萄糖溶液灌胃,依据OGTT试验的结果判定,血糖峰值>16.7mmol/L和葡萄糖灌胃后120min血糖>11.1mmol/L诊断为糖尿病,具备上述条件之一者为糖耐量受损(Impaired Glucose Tolerance IGT))。36周龄时,将到达糖耐量受损期(IGT期)OLETF大鼠26只,随即分为两组,一组附加牙周炎(O CP(+)组)(n=13),另外一组对照(O CP(-)组)(n=13)；LETO大鼠也随机分为两组,一组附加牙周炎(L CP(+)组)(n=10),另一组为正常对照(L CP(-)组)(n=10)。(2)CP(+)组大鼠给予丝线分别结扎于左、右上颌第一磨牙(molar1, M1)及第二磨牙(molar2, M2)牙颈部,并在结扎处牙周涂抹四种牙周常见致病菌混悬液。定期检查丝线,有脱落者及时重新结扎并涂菌。(3)每4周行一次OGTT,测体重,观察其体重和血糖的变化。并在36周龄和46周龄时,尾静脉采血测定其血清胰岛素水平的动态变化并计算糖尿病人胰岛素抵抗稳态模型(Homeostasis model assessment-insulin resistance HOMA-IR)值。(4)56周龄时,处死所有实验大鼠,采集血清检测大鼠血脂水平；收集组织样本,颌骨样本采用Micro-CT扫描,EDTA脱钙后HE染色,观察牙周炎症状态。四组之间的整体比较采用2×2析因设计资料的方差分析,两组间单因素数据比较采用独立样本t检验；同一处理因素两个不同水平之间以及同一水平不同处理因素之间的比较采用两独立样本的t检验。不同时间段多次测量的指标,总体各组和组内都用用重复测量的方差分析。同一时间同一组内有无干预的比较用两独立样本的t检验。结果本实验采用与人类T2DM发病及其相似的自发性T2DM大鼠OLETF大鼠,和其正常对照LETO大鼠作为研究对象。在36周龄时到达IGT期,模拟了人类T2DM的慢性发病的过程。OLETF大鼠表现为多食多饮多尿,倦怠少动,体重快速增加。随着实验时间延长,体重差异进一步加大。O CP(+)组、O CP(-)组随着大鼠周龄的增加,血糖AUC显著增加有统计学意义(F=5.952P=0.029),但在O组任意周龄,O CP(+)组比O CP(-)组AUC略有增高,但并无显著差异。O组大鼠血清甘油三酯显著高于L组(t=11.324P=0.002),O CP(+)组比O CP(-)组甘油三酯水平有增高,并无显著差异(t=1.031P=0.320)。O组大鼠血清胆固醇显著高于L组(t=39.089P=0.000),O CP(+)组比O CP(-)组甘油三酯水平显著增高(t=2.532P=0.024),并且糖尿病和牙周炎二者之间存在交互作用(F=4.743P=0.038)O组血清FI浓度和HOMA-IR值均显著高于L组。但O CP(-)组FI水平略高于O CP(+)组。O CP(-)组和O CP(+)组随着周龄增加HOMA-IR值的增加有显著性(F=38.233P=0.000<0.01),且同周龄时O CP(+)组比O CP(-)组HOMA-IR值高,但并无统计学差异。牙周结扎大鼠口内检查发现牙颈部结扎处有食物残留,牙龈红肿、牙槽骨吸收、牙周袋形成,在O CP(+)组牙周炎的炎症状态更重；Micro-CT的三维重建显示四组大鼠牙槽骨吸收体积,O CP(+)组与L CP(+)组牙槽骨骨丧失量明显分别高于O CP(-)组和L CP(-)组,差别有统计学意义(P=0.013,P=0.004),且O CP(+)组骨丧失量要多于L CP(+)组骨丧失量。O组牙槽骨吸收体积总体上明显多于L组(t==11.476P=0.010)。脱钙大鼠颌骨组织HE染色切片显示牙周组织附着丧失明显,胶原纤维破坏,牙周袋底炎症细胞浸润,肉芽组织形成,牙槽骨吸收明显。在OCP(+)组,炎症更重,可见结合上皮大幅根向迁移,牙周袋内及牙龈结缔组织内大量弥漫炎细胞浸润,甚至大量炎细胞游走到牙周袋内。结论OLETF大鼠在糖脂代谢和胰岛素抵抗方面可以较好的模拟人类T2DM的发病特征,是非常典型的T2DM动物模型。在OLETF大鼠附加牙周炎之后,牙周炎可促进胰岛素抵抗的程度和进度、不利于血糖控制,血清胰岛素代偿性增高,血脂增高,进而恶化T2DM的进程。T2DM也可加重牙周组织破坏,牙周炎症程度明显比单纯牙周炎组重。第二章慢性牙周炎对大鼠肾功和肾脏组织形态的影响目的通过在OLETF大鼠附加牙周炎,探讨慢性牙周炎是否对OLETF肾脏功能和肾脏组织形态学存在影响。为探讨牙周炎是否影响T2DM并发症DKD的发生发展提供病理基础。方法收集大鼠处死时血清,全自动生化分析仪测大鼠血清反映肾功的生化指标,包括血清白蛋白(Albumin ALB)、总蛋白(Total protein TP)、尿素(Urea)肌酐(Creatinine Cr)四个指标。取单侧肾脏,肾门处纵剖肾脏组织常规制作组织2-3μm切片,分别行常规HE染色和PAS、MASSON、PASM特殊染色,结合起来全面分析肾脏病理改变。通过分析PAS染色切片计算肾小球硬化指数(glomerulosclerosis index GSI),利用MASSON染色计算肾间质纤维化指数(renal interstitial fibrosis index RIFI),比较各组间大鼠以上指标的差异。实验结果用析因设计的方差分析和两独立样本的t检验。结果O组比L组血清总蛋白和白蛋白水显著下降(t=11.131P=0.002)。一致的是O CP(+)组比O CP(-)组血清ALB和TP的水平均有显著下降。而在L组有无CP干预,二者之间的比较没有明显差异。O组大鼠血清肌酐水平均显著高于L组(t=9.099P=0.005)。L组大鼠有无CP干预肌酐水平无明显变化。O CP(+)组大鼠血清肌酐水平明显高于O组,差异有统计学意义(t=4.443P=0.000<0.01)。血清尿素结果显示O组比L组显著升高(P=0.024)。L CP(-)与L CP(+)组尿素水平接近。而O CP(+)组比O CP(-)尿素升高明显,但并无统计学差异。(t=1.484,P=-0.160)。L CP㈩组组织学特征与L组接近,表现为正常肾脏的组织学特点。O组大鼠肾小球直径增大,鲍曼氏囊囊壁增厚明显,肾小球球囊部分粘连,可见囊腔扩大。肾小球系膜基质表现为中度至重度增生,呈弥漫性或结节状,再加上肾小球毛细血管基底膜增厚,部分区域出现局灶性肾小球硬化；肾小球周围出、入球小动脉管壁增厚。部分肾小管扩张,管腔内可见蛋白样物质或蛋白管型。肾小管上皮细胞玻璃样或空泡变性,部分区域甚至可见肾小管上皮萎缩、坏死、脱落,导致肾小管正常结构消失,晚期被纤维组织替代。间质可见散在炎细胞,严重者可见淋巴细胞和单核细胞成灶性浸润,肾间质纤维化。两种疾病的复合组病变程度更重。O组大鼠肾GSI和RIFI均显著高于L组大鼠(t=85.112P=0.000<0.01,t=27887.6P=0.000<0.01)。在L CP(+)组,GSI略高于L CP(-)组,二者之间没有显著性差异(P=0.076)。OCP(+)组大鼠GSI与OCP(-)组比较有显著性差异(P值均<0.01)。而且T2DM和牙周炎对大鼠GSI存在交互效应(F=75.060,P=0.000<0.01)。RIFI也是相似的结果,在L CP(+)组,RIFI也略高于L CP(-)组,但二者之间没有显著性差异(P=0.296)。O CP(+)组大鼠与OCP(-)组比较有显著性差异(t=23.709P<0.01)。而且T2DM和牙周炎对大鼠RIFI存在交互效应(F=477.875,P=0.000)。值得注意的是炎症浸润特征在O组很明显。在O CP(-)组8只大鼠组织切片中发现3只大鼠有大量散在炎细胞浸润或者大灶性炎细胞浸润(3/8),而在OCP㈩组中,有大量散在炎细胞浸润或者大灶性炎细胞浸润的大鼠例数明显增加,为6只(6/8),且炎细胞大多是单核细胞和巨噬细胞。结论本研究发现慢性牙周炎未对正常大鼠肾脏结构和功能产生显著影响；但在T2DM肾脏已有损害的情况下,慢性牙周炎显著增加了肾间质炎细胞浸润的风险,其促进了肾小球硬化、肾小管破坏及肾间质纤维化,加重了肾脏损害,恶化了肾功能,并且T2DM和牙周炎在肾脏病变发生中有交互、协同作用。第三章慢性牙周炎对OLETF大鼠肾脏病变调控蛋白及其mRNA表达的影响目的检测各组大鼠肾脏组织中Ⅳ型胶原、TGF-β1、MMP-2, MMP-9, TIMP-1蛋白和基因转录水平的表达差异。分析牙周炎是否对肾脏组织代谢密切相关的关键物质的蛋白表达和基因转录水平产生了影响,进而探讨T2DM时慢性牙周炎影响肾脏损害可能的病理机制。方法采用免疫组化ENVISION二步法检测四组大鼠肾脏组织中Ⅳ型胶原、TGF-β1、MMP-2, MMP-9, TIMP-1蛋白的表达,进行半定量分析；ELISA法检测大鼠血清中TGF-β1的浓度；另采用实时定量PCR(Real-Time PCR)技术的Sybr green (荧光染料掺入)法来进行各组大鼠肾脏组织中Ⅳ型胶原、TGF-β1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、的mRNA基因表达差异分析。实验结果用析因设计的方差分析和两独立样本的t检验。结果IV型胶原蛋白表达于肾小球基底膜和系膜基质,血管壁、肾小管基底膜等部位。O组表达明显高于L组,且O CP(+)组与O CP(-)组之间表达量有统计学差异。(t=-11.099P=0.000<0.01),而L CP(+)组与L CP(-)组之间表达没有差异(t=2.032P=0.062)。TGF-β1蛋白表达较广泛,主要集中在近曲小管上皮胞浆的部位,另外远曲小管上皮胞浆也有中等阳性的表达；肾小球基质和内皮的部位可见极少量表达。四组大鼠中TGF-β1均有表达,L组表达较低,O组比L组表达显著增强(t=2034.01P=0.000<0.01)。两组内在CP干预后其表达都明显增强。分组和牙周炎对TGF-β1蛋白的表达都有显著影响,并且牙周炎和糖尿病对TGF-β1蛋白的表达有交互相应(F=5.729P=0.024)。TGF-β1mRNA表达趋势与蛋白表达趋势一致。L组附加CP后其表达显著增高(t=4.851P=0.000<0.01)。MMP-9蛋白主要表达于近曲小管和远曲小管上皮细胞,少量表达于系膜细胞。正常对照L组MMP-9的表达要明显高于O组(t=297.868P=0.000<0.01),L CP(+)组与L CP(-)组相比表达明显降低(t=11.274P=0.000<0.01)。O CP(-)组MMP-9蛋白表达的值与O CP㈩组接近,没有统计学差异(t=1.885,P=0.085)。T2DM和牙周炎之间有交互效应(F=66.397P--0.000)。四组大鼠肾脏MMP-9mRNA表达与其蛋白的表达总体趋势也一致,在正常L组大鼠肾脏都有高水平表达,而O组显著低于L组。但基因表达上O CP(+)组明显低于O CP(-)组(t=4.360P=0.001)。MMP-2蛋白主要表达于近曲小管上皮细胞胞浆,远曲小管和肾小球可见微量表达,还可以发现在炎症浸润区域,炎细胞有少量表达。表达量最高的仍然是L两组,L CP㈩组与L CP(-)组相比表达明显降低(t=9.030P=0.000<0.01)。O组比L组显著降低(t=3184.226P=0.000<0.01)。O CP(+)组MMP-2蛋白表达值最低,阳性着色区域不明显。主效应分组和牙周炎对MMP-2蛋白的表达都有显著影响,主效应分组和牙周炎之间有交互效应(F=13.529P=0.001)。四组大鼠肾脏MMP-2mRNA表达与其蛋白的表达趋势正好相反。MMP-2基因表达O组显著高于L组(P<0.01),并且O CP(+)组的表达显著高于O CP(-)组(t=2.475P=0.027)。TIMP-1蛋白表达于近曲小管、远曲小管、肾间质和肾小球基质区域。O组TIMP-1表达明显高于L组(t=1721.404P=0.000<0.01),O CP(+)组比O CP(-)组表达明显增强(t=9.007P=0.000<0.01),L CP㈩组与L CP(-)组相比表达接近,没有统计学差异(t=1.245P=0.234)。四组大鼠肾脏TGF-β1, TIMP-1和IV型胶原mRNA表达与各自蛋白的表达趋势一致,即在L组大鼠肾脏都有正常的低水平表达,而以上三者在O组表达量比L组表达都显著上调(P<0.01),并且在O CP㈩组表达都略高于O CP(-)组,差异均没有统计学意义。结论：牙周炎复合糖尿病时,促进了肾脏组织以及血清中促纤维化的核心因子TGF-β1的表达增高,也促进了抑制胶原降解的酶TIMP-1的高表达；却抑制了细胞外机制降解酶MMP-2,MMP-9的正常表达,从而导致了肾脏组织IV型胶原沉积增多。糖尿病状态下,肾脏细胞外基质的代谢平衡已经被打破,胶原生成增多,降解减少；而在糖尿病复合牙周炎后,这种不平衡更加恶化,牙周炎加剧了细胞外基质的代谢失衡,加速肾小球硬化和肾间质纤维化,促进肾脏功能的进一步丧失。