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雄蚕蛾作为传统的滋补佳品,具有抗疲劳、延缓衰老和免疫调节等功效。蚕蛾蛋白含量丰富,将其水解成短肽分子后能解决部分人群食用后的过敏问题,利用雄蚕蛾活性肽开发相关功能食品将带来更好的健康效益和市场前景。本文以雄蚕蛾蛋白为原料,利用酶解技术制备雄蚕蛾活性肽,以体外抗氧化活性为筛选指标,运用超滤、Sephadex G-25葡聚糖凝胶、制备液相逐级分离纯化活性肽段,并对目标肽段进行了一级结构鉴定;研究了雄蚕蛾活性肽对骨骼肌细胞L6的糖代谢影响,初步探明其通过AMPK信号通路调节能量代谢的作用机制。主要研究结果如下:1、雄蚕蛾活性肽(MSH)的分离纯化及抗氧化性评价采用复合酶(Alcalase碱性蛋白酶、丹尼斯克碱性蛋白酶)对雄蚕蛾蛋白进行酶解,经测定MSH相对分子质量主要集中在1000 Da~3000 Da。分别用3 kDa和1 kDa的超滤膜对雄蚕蛾酶解产物分级后得到3个组分:MSH-Ⅰ(M_W<1kDa),MSH-Ⅱ(M_W 1~3 kDa)和MSH-Ⅲ(M_W>3kDa),测定各组分O RAC值和DPPH清除能力,抗氧化活性大小MSH-Ⅱ>MSH-Ⅰ>MSH-Ⅲ,其中MSH-Ⅰ和MSH-Ⅱ的ORAC值并无显著性差异(P>0.05)。采用Sephadex G-25凝胶柱分离纯化分子量<3kDa的组分,分离得到2个洗脱峰P1和P2,其中P2的抗氧化性远高于P1。经氨基酸分析,P2组分的中的蛋氨酸、酪氨酸、赖氨酸、组氨酸等抗氧化性较强的氨基酸所占比例大于P1组分。采用HPLC-DPPH法能够快速检测、筛选MSH中抗氧化活性较强的组分,并对目标肽段用制备液相收集起来。经SunFire Prep C18柱和XBridge CSH Prep C18柱分离后得到P2-A和P2-B组分。P2-B的抗氧化活性远高于P2-A(P<0.05),ORAC值高达1384.64μmol TE/g,纯度达90%。通过MALDI-TOF-MS分析目标肽段P2-B的分子量为792.55 Da,氨基酸组成分析其由Ser、Gly、Ala、Val、His、Arg组成。2、采用细胞实验评价MSH对L6骨骼肌细胞葡萄糖代谢的调节作用研究发现雄蚕蛾蛋白酶解产物及其不同组分MSH-Ⅰ(M_W<1kDa),MSH-Ⅱ(M_W1~3 kDa和MSH-Ⅲ(MW>3kDa)均可促进L6骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取,但MSH及各组分间无显著性差异(P>0.05)。研究不同时间(6、12、18、24、30、36h)及不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL)MSH对L6骨骼肌细胞葡萄糖摄取量的影响,结果表明0.4 mg/mLMSH培养L6细胞24 h,促进细胞摄取葡萄糖效果较好。0.4 mg/mLMSH、Insulin(胰岛素)和AICAR(AMPK激活剂)均能增加L6细胞的葡萄糖摄取量;而用25μmol/L Compound C(AMPK抑制剂)预处理30 min,然后再用MSH处理24 h,以Insulin和AICAR作为对照,结果显示Compound C能抑制MSH和AICAR对骨骼肌L6细胞的葡萄糖摄取的刺激作用(P<0.05),但不影响Insulin刺激L6细胞葡萄糖摄取作用(P>0.05)。采用实时定量PCR检测AMPKαmRNA表达水平,Western-blot检测磷酸腺苷活化蛋白激酶α(AMPKα)、p-AMPKα、葡萄糖转运体-4(glucose transporter 4,GLUT4)蛋白表达水平,结果表明MSH能增加L6细胞AMPKαmRNA和蛋白表达,p-AMPKα/AMPKα比值升高,GLUT4膜蛋白表达也明显增加。推测MSH可能激活AMPKα使其磷酸化,增加GLUT4向细胞膜的转位,促进L6细胞的葡萄糖摄取,从而调节细胞内糖代谢水平。综合分析,MSH可通过AMPK信号通路促进细胞葡萄糖摄取。