目的:通过高脂饮食建立高脂致Aβ增高小型猪动物模型,观察高胆固醇血症胆固醇代谢异常状态对脑内β淀粉样蛋白生成的影响,探讨胆固醇代谢异常状态下脑胆固醇代谢紊乱相关因素与AD早期病理改变β淀粉样蛋白生成的关系;运用具有不同功效的中药复方干预此动物模型,并对其作用机制进行探讨,为在早期阶段通过减少AD典型病理特征Aβ生成及沉积从而防治AD提供实验依据。材料与方法:广西巴马小型猪55只,月龄6-8个月,体重(29.88±2.27)kg,雄性,肠道菌群正常,体健,由泰州泰和生物科技有限公司提供。伦理符合中华人民共和国卫生部动物实验管理条例(No.55,2001)和辽宁中医药大学实验动物管理条例规定。实验室温度为(20.80±2.97)℃,湿度(47.30±15.31)%,实验动物均为单笼饲养。适应性饲养1周后,采用随机数字表法将55只小型猪分为两组:正常组5只,手术组50只。正常组给予基础饮食,手术组(第2周进行冠脉球囊挤压伴拉伤,术前禁食8h,禁水2小时),术后继续予以高热量高脂适量胆盐喂饲(防止小猪连续吃大量油腻食物出现厌食,加胆盐是防止消化不良)。日进食量为上周所称体重的3%,自由饮水。术中有8只小型猪死亡;应用随机数字表将存活的42只小型猪重新进行随机分组:模型组(n=7)、健脾祛痰化瘀组(n=7)、健脾祛痰组(n=7)、健脾组(n=7)、祛痰化瘀组(n=7)、西药组(n=7)至此,健脾组加入健脾方,健脾祛痰组加入健脾祛痰方,祛痰化瘀组加入祛痰化瘀方,健脾祛痰化瘀复方组加入健脾祛痰化瘀方,加入相应剂量的中药复方按照体重对应标准,饲喂至24周,指标检测如下:1.实验期间每4周称量小型猪的体重,观察小型猪体重变化情况。2.实验第0周及实验开始后第4周,第12周,第24周禁食16h后耳缘静脉抽血3ml,全自动生化分析仪检测血脂(TC、TG、LDL、HDL)水平,观察不同时间点血脂四项的变化情况。3.免疫组织化学染色法检测Aβ阳性细胞在大脑组织的分布。4.免疫组织化学法观察Aβ在大脑组织的含量及水平。5.免疫组织化学法检测Aβ代谢相关因子BACE1及脑胆固醇代谢关键因子HMG-Co AR、CYP46a、ABCA1在脑内的含量及在神经元细胞内的表达。6.免疫蛋白印迹法(Western Blot)检测Aβ代谢相关因子BACE1及脑胆固醇代谢关键因子HMG-Co AR、CYP46a、Apo E、ABCA1的蛋白表达。本实验所有数据结果使用SPSS17.0软件进行统计分析,结果用平均值加减标准差(—X±S)表示,组与组之间比较采用单因素方差分析。(P<0.05说明有显著性差异,P<0.01说明有非常显著性差异。)结果:1.正常组与模型组小型猪的体重增长变化显示:模型组与正常组在第0周体重增长并无明显差异,两组巴马小型猪体重增长从第4周起开始有显著性差异(P<0.05);2.正常小猪在成长过程中,血脂的变化不明显;而模型组巴马小型猪血脂四项变化显著,结果显示:高脂饮食1周,可使小型猪甘油三酯升高2.86倍,使总胆固醇升高3.84倍,使低密度脂蛋白升高7.40倍,使高密度脂蛋白升高2.56倍;随着高脂饮食时间延长,小型猪甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)持续升高,第24周趋于稳定,而高密度脂蛋白随高脂饮食时间增加呈降低趋势;3.免疫组织化学法显示高脂饮食造成的高血胆固醇水平增加了脑Aβ含量,模型组巴马小型猪脑Aβ含量显著高于正常组(0.26±0.03 pg/mg protein vs 0.1110±0.01 pg/mg protein,p<0.01)。免疫组织化学法检测平均光密度值(AOD)正常组与模型组相比较,有统计学意义。(P<0.01)。免疫组织化学染色显示与正常组相比较,模型组脑组织神经元细胞结构呈棕黄色颗粒聚集,表示脑组织内Aβ阳性细胞表达增多;4.健脾祛痰组调节TC、HDL、LDL的能力强于其余两组,健脾祛痰化瘀组调节TG的能力强于其余两组;5.与模型组比较,健脾组、健脾祛痰组、祛痰化瘀组、健脾祛痰化瘀组均能明显降低脑内Aβ含量(P<0.01);健脾祛痰化瘀组较健脾组、健脾祛痰组、祛痰化瘀组减少Aβ含量,且有统计学意义(P<0.01)健脾组、健脾祛痰组、祛痰化瘀组之间比较,无统计学差异(P>0.05);6.经健脾祛痰化瘀法干预后,健脾组、健脾祛痰组、祛痰化瘀组、健脾祛痰化瘀组脑内BACE1蛋白表达明显降低;证明血胆固醇降低引起的脑Aβ降低与Aβ生成相关因子的蛋白表达的改变有关;7.免疫组织化学法检测ABCA1实验结果显示,与正常组相比较,模型组及中药复方各组脑组织ABCA1含量增加,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比较,健脾组、健脾祛痰组、祛痰化瘀组、健脾祛痰化瘀组ABCA1含量升高,差异有统计学意义(P<0.01);与健脾祛痰化瘀组相比,健脾组、健脾祛痰组、祛痰化瘀组ABCA1含量降低,差异有统计学意义(P<0.01);健脾组、健脾祛痰组、祛痰化瘀组组间比较差异无统计学意义(P>0.01)。免疫组化染色显示模型组阳性细胞表达增多,而药物组阳性细胞表达减少,与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.01);8.免疫组织化学法检测HMG-Co AR结果显示,与正常组相比,模型组及中药复方各组脑组织HMG-Co A含量增加,且有显著性差异(P<0.01);与模型组相比较,健脾组、健脾祛痰组、祛痰化瘀组及健脾祛痰化瘀组HMG-Co AR含量增加,差异有统计学意义(P<0.01);与健脾祛痰化瘀组相比,健脾组,健脾祛痰组、祛痰化瘀组HMG-Co AR含量减少,差异有统计学意义(P<0.01);健脾组,健脾祛痰组,祛痰化瘀组之间比较,HMG-Co AR差异无统计学意义(P>0.01),免疫组化染色显示模型组阳性细胞表达增多,而药物组阳性细胞表达减少,与模型组相比,差异有统计学意义;9.免疫组织化学法检测CYP46a结果显示,与正常组相比较,模型组、复方各组脑组织CYP46a含量增加,且有显著性差异(P<0.01);与模型组相比较,复方组脑组织内CYP46a含量增加,差异有统计学意义(P<0.01);与健脾祛痰化瘀组相比,健脾组、健脾祛痰组、祛痰化瘀组脑组织CYP46a含量减少,差异有统计学意义(P<0.01);与健脾组相比,健脾祛痰组、祛痰化瘀组脑组织CYP46a含量增加,且差异有统计学意义(P<0.01);与健脾祛痰组相比,祛痰化瘀组CYP46减少,差异无统计学意义。(P>0.05)。免疫组化染色显示模型组阳性细胞表达增多,而药物组阳性细胞表达减少,与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.01);10.Western Blot结果显示,与正常组相比较,模型组、中药复方组脑组织HMG-Co AR蛋白表达升高,且差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比较,复方组HMGR蛋白表达升高,且差异有统计学意义(P<0.01);与健脾祛痰化瘀组相比,健脾组、健脾祛痰组、祛痰化瘀组脑组织HMG-Co AR蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.01)与健脾组相比,健脾祛痰组、祛痰化瘀组HMG-Co AR蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);健脾祛痰组、祛痰化瘀组相比,HMGR蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);11.Western Blot结果显示,与正常组相比,模型组、复方组脑组织CYP46a蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比较,复方组脑组织内CYP46a1蛋白表达均有升高,差异有统计学意义(P<0.01);与健脾祛痰化瘀相比,祛痰化瘀组、健脾祛痰组及健脾组脑组织CYP46a蛋白表达降低,差异有统计学意义;健脾组、健脾祛痰组、祛痰化瘀组脑组织CYP46a1蛋白表达无显著性差异。(P>0.05);12.Western Blot结果显示,与正常组相比较,模型组、复方组脑组织Apo E蛋白表达升高,且有显著性差异(P<0.01);与模型组相比,复方组脑组织内Apo E蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.01);与健脾祛痰化瘀组相比较,祛痰化瘀组、健脾祛痰组及健脾组脑组织Apo E蛋白表达升高,有显著性差异(P<0.01);健脾组、健脾祛痰组、祛痰化瘀组脑组织蛋白表达差异无统计学意义。(P>0.05);13.Western Blot结果显示,与正常组相比,模型组、复方组脑组织ABCA1蛋白表达升高,且有显著性差异(P<0.01);与模型组相比较,复方组对脑组织内ABCA1蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.01);与健脾祛痰化瘀组相比,健脾祛痰组、祛痰化瘀组及健脾组脑组织ABCA1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.01);健脾组、健脾祛痰组、祛痰化瘀组之间相比,脑组织ABCA1蛋白表达无显著性差异。(P>0.05)。结论:1.高脂饮食可影响血脂四项水平,高脂饮食1周可造成冠状动脉粥样硬化模型猪血脂异常,随高脂饮食时间延长,血脂四项中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)的浓度升高,高密度脂蛋白(HDL)浓度降低;2.高脂饮食增加了外周血血脂浓度,外周血脂水平可影响巴马小型猪脑内Aβ的水平的改变,使脑内Aβ含量增加,高脂饮食24周可建立高脂致Aβ增高动物模型;3.健脾方、健脾祛痰方、祛痰化瘀方、健脾祛痰化瘀方可调节巴马小型猪模型的血脂水平,健脾祛痰化瘀方优于健脾、健脾祛痰及祛痰化瘀方;4.健脾方、健脾祛痰方、祛痰化瘀方、健脾祛痰化瘀方可减少Aβ在脑内的沉积,减少Aβ的表达;5.健脾方、健脾祛痰方、祛痰化瘀方、健脾祛痰化瘀方减少Aβ含量和生成的可能机制之一是通过降低Aβ代谢关键因子BACE1蛋白表达来实现的;6.脑胆固醇代谢异常能够影响Aβ生成与代谢;7.健脾方、健脾祛痰方、祛痰化瘀方、健脾祛痰化瘀方可使脑中胆固醇合成及转出的关键酶Apo E蛋白下调,使HMGR、ABCA1、和CYP46的蛋白表达上调,其中健脾祛痰化瘀方作用优于健脾、健脾祛痰、祛痰化瘀、健脾祛痰化瘀方。8.健脾方、健脾祛痰方、祛痰化瘀方、健脾祛痰化瘀方干预高脂所致Aβ增高动物模型的可能机制是通过下调Apo E蛋白表达,上调HMGR、ABCA1、和CYP46的蛋白表达来发挥作用。9.健脾方、健脾祛痰方、祛痰化瘀方、健脾祛痰化瘀方可能是通过调节巴马小型猪的外周血脂水平、调节Aβ生成相关分泌酶β分泌酶的活性及BACE1蛋白表达、下调Apo E蛋白表达,上调CYP46a HMG-Co AR、ABCA1等蛋白的表达来干预阿尔茨海默病早期β淀粉样蛋白形成的病理过程,从而在早期阻抑或延缓AD的发生发展。10.健脾方、健脾祛痰方、祛痰化瘀方、健脾祛痰化瘀方在调脂、调节Aβ生成及改善脑胆固醇代谢方面效果显著,健脾祛痰化瘀方作用大于健脾祛痰方、祛痰化瘀方大于健脾方。说明健脾祛痰化瘀方配伍精良,健脾、祛瘀、化痰三者均不可少。