论文部分内容阅读
本文通过构建GtHⅠβ亚基和GtHⅡβ亚基原核表达质粒，并在大肠杆菌中诱导表达，提供标准品及用于制备抗体，解决天然GtH蛋白难以纯化的问题。同时对GtHⅠβ亚基和GtHⅡβ亚基在各组织中mRNA的表达情况进行了研究，试图从分子水平了解斜带石斑鱼生殖生长的一些规律。主要研究内容包括如下：1.运用半定量RT-PCR技术结合Southern杂交技术分析了GtHⅠβ和GtHⅡβ基因在雌性性成熟的斜带石斑鱼的12组织中的表达情况。总体来说GtHⅡβ在各组织中的表达量明显高于GtHⅠβ，说明GtHⅡ在鱼类性腺成熟和排精排卵时期起到更重要的作用。值得注意的是，性腺在雌性性成熟的斜带石斑鱼GtHⅠβ和GtHⅡβ都具有较高的表达量。提示性腺可能也是一个促性腺激素分泌器官，调控斜带石斑鱼的生殖生理活动。2.根据已知斜带石斑鱼GtHⅡβ亚基cDNA序列设计一对引物(GtHⅡβF/R)，以斜带石斑鱼脾脏cDNA为模板进行聚合酶链式反应(RT-PCR)，产物回收后连接到pGEM-Teasy载体上，筛选阳性质粒并测序得以验证。通过对表达菌株在不同温度、不同IPTG浓度和不同诱导时间的研究发现，两种菌株在37℃和25℃均能成功地表达目的蛋白。通过构建表达质粒，得到表达GtHⅡβ亚基蛋白的菌株GtHⅡβ-PET22b(+)-BL21，诱导条件均为在0.1mMIPTG和37℃下诱导7小时。3.将斜带石斑鱼GtHⅠβ基因克隆于融合表达载体PET22b(+)构建成表达质粒GtHⅠβ-PET22b(+)，转化进表达菌株BL-21(DE3)后，经IPTG诱导成功表达了GtHⅠβ-PET22b(+)融合蛋白。经过对表达条件的初步探索，本文确定GtHⅠβ-PET22b(+)/BL-21(DE3)的最佳诱导培养条件为：当OD600值为0.4-0.6时加入终浓度0.1-1.0mol/L的IPTG在25℃诱导5-7小时。