目的:近年来随着人民生活水平的提高,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfatty livet disease NAFLD)患者日益增多。NAFLD主要包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝硬化三种病理类型。目前尚无防治NAFLD的理想药物,中医药具有一定的优势。在NAFLD发病过程中的不同阶段,中医的病机不同。导师盛国光教授在临床实践中发现,痰湿阻滞、瘀血阻络为NAFLD的基本病机,但在NAFLD发病过程中的不同阶段,其病机又略有差异,NAFLD早期的病机多伴有肝郁脾虚;后期的病机则多伴有湿郁化热、肝肾不足。导师盛国光教授根据临床经验针对NAFLD病机的差异分别拟用不同的治法,在临床上取得了较好的疗效。本课题在前期研究有效治法组方的基础上,采用国内外公认的NAFLD大鼠模型,观察中医各治法对NAFLD大鼠血清生化、脂肪酸代谢、炎性因子、脂质过氧化、肝脏病理、线粒体细胞色素氧化酶基因表达等指标变化的影响,探讨NAFLD的发病机制及中医的证治特点和病机演变规律。方法:实验分三部分进行第一部分:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠模型的建立及不同的中医治法在NAFLD不同时段对大鼠血清生化指标、肝组织病理等的影响(实验1-2)SPF级Wistar大鼠80只,随机分为5组,每组16只:正常组、模型组、对照药物治疗组(功效为活血化瘀、化痰利湿)、药物A方治疗组(功效为疏肝健脾、活血化瘀、化痰利湿)、药物B方治疗组(功效为化痰消瘀、清热利湿、补益肝肾)。采用高脂饮食(普通饲料加15%猪油、2%胆固醇、5%蛋黄粉)复制NAFLD大鼠模型。分别在实验第8、12周时,每组随机取8只大鼠,取血清,留取肝脏做指标检测。用全自动生化分析仪检测大鼠血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶,放免法检测肿瘤坏死因子-α,计算肝指数,按试剂盒操作说明检测各组大鼠肝组织超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量、还原型谷胱甘肽含量、血清游离脂肪酸,肝组织HE染色,光学显微镜下评估肝组织脂肪变性和炎症活动程度。第二部分:以方测证探讨NAFLD的中医证治特点及不同治法对NAFLD脂质代谢、肝脏功能、胰岛素抵抗指数及肝组织病理等各项指标的影响(实验3-5)SPF级Wistar大鼠72只,雌雄各半,随机分为9组,每组8只:正常组、模型组、对照药物治疗组、药物A方治疗组、药物B方治疗组、4-8周用A方,8-12周用B方治疗组、4-8周用B方,8-12周用A方治疗组、先空白,第8-12周用A方治疗组、先空白,第8-12周用B方治疗组。采用高脂饮食复制NAFLD大鼠模型。用全自动生化分析仪检测大鼠血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、胰岛素含量、胰岛素抵抗,放免法检测肿瘤坏死因子-α,计算肝指数,按试剂盒操作说明检测各组大鼠肝组织超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量、还原型谷胱甘肽含量、血清游离脂肪酸,肝组织HE染色,光学显微镜下评估肝组织脂肪变性和炎症活动程度.第三部分:肝线粒体在NAFLD中的病理改变、基因表达及中医多法干预的影响(实验6-7)SPF级Wistar大鼠40只,随机分为5组,每组8只:正常组、模型组、对照药物治疗组、药物A方治疗组、药物B方治疗组。采用高脂饮食复制NAFLD大鼠模型。取大鼠肝组织进行电镜检测,采用RT-PCR法检测大鼠肝线粒体细胞色素氧化酶基因COXⅡ、Ⅲ的表达,采用Western-blot技术检测各组大鼠肝线粒体细胞色素氧化酶COXⅠ蛋白表达的变化。结果:第一部分:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠模型的建立及不同中医治法在NAFLD不同时段对大鼠血清生化指标、肝组织病理等的影响(实验1-2)成功建立大鼠NAFLD模型。1.实验第8周时,药物A方组降低NAFLD大鼠血清AST、ALT、TG、TCH、FFA、LDL、TNF-α水平、肝组织MDA含量;提高肝组织SOD、GSH-ST含量的疗效显著优于其他治疗组(P＜0.05或P＜0.01)。在病理影响方面,药物A方组减轻肝细胞脂肪变、降低炎症活动度的疗效与其他治疗组相比有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01).2.实验第12周时,药物B方组降低NAFLD大鼠血清AST、ALT、FFA、TNF-α水平、肝指数、肝组织MDA含量;提高肝组织SOD、GSH-ST含量的疗效显著优于其他治疗组(P＜0.05或P＜0.01)。在病理影响方面,药物B方组减轻肝细胞脂肪变、降低炎症活动度的疗效与其他治疗组相比有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。第二部分:以方测证探讨NAFLD的中医证治特点及不同治法对NAFLD脂质代谢、肝脏功能、胰岛素抵抗指数及肝组织病理等各项指标的影响(实验3-5)实验第12周时,先A方后B方治疗组降低NAFLD大鼠血清TG、TCH、LDL、FFA、TNF-α、ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、INS、IR、肝指数及肝组织MDA含量;提高NAFLD大鼠的肝组织SOD、GSH-ST含量的疗效显著优于其他治疗组(P＜0.05或P＜0.01)。在病理影响方面,先A方后B方治疗组减轻NAFLD大鼠肝细胞脂肪变,降低炎症活动度的疗效与其他治疗组相比有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。第三部分:肝线粒体在NAFLD中的病理改变、基因表达及中医多法干预的影响(实验6-7)1正常组相比,肝细胞线粒体在各造模组中有不同程度的病理改变。在12周时,药物B方治疗组肝细胞线粒体增生复制活跃,未见明显形态和结构的改变,与模型组、对照药物组、药物A方治疗组比较,其保护肝线粒体的疗效较优。2与正常组相比,NAFLD模型大鼠肝线粒体细胞色素氧化酶COXⅡ、ⅢmRNA、COXⅠ蛋白低表达;药物B方治疗组提高肝线粒体细胞色素氧化酶COXⅠ蛋白和COXⅡmRNA表达的疗效显著优于其他治疗组(P＜0.05或P＜0.01)。结论:1.动物模型的建立采用高脂饲料复制大鼠NAFLD动物模型,在实验第8周时,模型组大鼠肝组织病理改变符合单纯性脂肪肝病变;实验第12周时,模型组大鼠肝功能损害,血脂增高,肝脏的病理变化符合NASH病理表现,成功复制了大鼠NAFLD模型。2.NAFLD的病理机制和中医证型的研究2.1不同阶段NAFLD发病机制的变化及中医证型的演变在大鼠NAFLD模型实验第8周时,大鼠肝脏病理主要表现为肝细胞大泡性脂肪变,为NAFLD单纯性脂肪肝阶段,中医多种治法干预的结果表明,在此阶段以疏肝健脾、活血化瘀、化痰利湿为治法的干预措施疗效较佳;在实验第12周时,大鼠肝脏病理表现为肝细胞混合性脂肪变,汇管区中度炎症改变,为NAFLD脂肪性肝炎阶段表现,中医干预结果表明,以化痰消瘀、清热利湿、补益肝肾为治法的疗效较优。在单纯性脂肪肝时期,胰岛素抵抗、脂肪酸代谢失衡是脂肪肝的主要发病因素,脂质过氧化、氧应激,各种细胞因子诱导的炎症反应为病变进展为NASH的主要发病机制。中医不同治法在NAFLD各时期的疗效差异表明,NAFLD的中医证型在基本病机痰湿阻滞、瘀血阻络的基础上,在单纯性脂肪肝阶段兼有肝郁脾虚;在脂肪性肝炎阶段兼有湿郁化热、肝肾不足的特点。2.2肝线粒体在NAFLD发病中的作用机制线粒体脂肪酸氧化代谢功能受损,清除自由基能力减低,是引起脂质代谢失调,过氧化损伤、氧应激的重要因素,也是导致NAFLD病情进展的重要原因之一。3.中医辨证治疗对NAFLD的防治作用及机理3.1中医不同治法对NAFLD各阶段干预的影响中医根据NAFLD发病过程中的临床表现将其证型分为肝郁脾虚、痰湿阻滞、瘀血阻络、湿郁化热、肝肾不足等,根据病机不同分别用疏肝健脾、活血化瘀、化痰利湿、清利湿热、补益肝肾等治法进行干预,实验结果表明在大鼠NAFLD模型的早期阶段采用疏肝健脾、活血化瘀、化痰利湿的治法有较好疗效,在后期阶段运用化痰消瘀、清热利湿、补益肝肾的治法疗效较好。中医各治法的疗效主要表现在改善肝功能、肝指数和肝脏炎症活动度,降低炎症因子水平、游离脂肪酸、血清脂质水平、提高抗氧自由基能力等方面。3.2中医辨证干预NAFLD的防治机理采取早期阶段运用疏肝健脾、活血化瘀、化痰利湿治法,结合后期阶段化痰消瘀、清热利湿、补益肝肾的治疗措施在防治NAFLD的过程中取得了最佳治疗效果,防治NAFLD的机理表现在降低血脂、低密度脂蛋白、游离脂肪酸、炎症因子水平,减轻脂质过氧化损伤、肝脏炎症活动度,改善胰岛素抵抗等方面。3.3肝线粒体在NAFLD中的变化及中药的干预机制细胞色素氧化酶(COX)是衡量线粒体氧化能力的关键酶,大鼠COX基因、蛋白的表达下降,表明线粒体氧化代谢功能受损,清除自由基能力减低,是导致脂质代谢失调,过氧化损伤的主要因素,中药干预NAFLD的机制可能是通过调节COX基因、蛋白的表达而阻止和延缓了NAFLD病程的进一步发展。