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[研究背景]肾纤维化是一个慢性、进行性的肾脏疾病,主要表现为肾小球硬化和间质纤维化。目前认为内皮细胞（endothelial cells,ECs）功能障碍是加重肾纤维化的又一新机制。ECs在肾纤维化微环境中受到外界炎症、缺氧等因素刺激,可发生间质样转化（endothelial to mesenchymal transition,EndMT）等命运转变,进而参与调控肾纤维化进展。该过程一方面可导致ECs功能障碍、血管屏障功能破坏、灌流能力丢失等,进而加重组织缺氧程度;另一方面可通过分泌大量细胞因子活化肌成纤维细胞,导致病理性ECM大量沉积。前期研究表明,EndMT等命运转变过程是参与调控肾纤维化进展的关键因素,靶向调控ECs命运转变是治疗肾纤维化等疾病的重要方式。因此,深入探究ECs命运可塑性调控机制有助于寻找纤维化疾病治疗的新靶点,具有重要的研究价值和科学意义。Notch信号是一条通过邻近细胞间相互接触传递信息的信号通路。文献及课题组前期研究表明,Notch信号是调控血管新生以及维持稳态的关键因素,敲除EC中Notch信号下游关键转录因子RBP-J阻断Notch信号可导致血管稳态丢失,EC过度活化,进而导致视网膜以及肝脏等组织器官紊乱。文献报道发现,Notch信号能够影响病理状态下的EndMT参与胚胎发育和疾病进展。前期研究发现,Notch信号通路的成员和下游靶分子在慢性肾脏疾病（chronic kidney disease,CKD）的临床样本及大鼠、小鼠肾纤维化模型的组织中有不同程度的表达,提示Notch信号和肾纤维化密切相关。然而,关于Notch信号参与肾纤维化的细胞及分子机制仍无明确的报道和阐述。文献及课题组前期发现Notch信号可通过下游Snail2、eNOS以及miR-342-5p等分子或信号通路促进EndMT,进而参与调控心脏发育以及血管新生等过程,然而Notch信号能否通过调控EndMT参与肾纤维化进程及其下游分子机制仍然需要更进一步去深入阐明。[实验目的]为了进一步验证ECs中Notch信号改变是否可以通过调控EndMT影响肾纤维化进程。课题组利用临床CKD 3期及以上肾活检样本和单侧输尿管结扎（unilateral ureteral occlusion,UUO）的小鼠肾间质纤维化模型证实EndMT存在,同时利用EC特异性Notch信号活化或阻断的遗传修饰小鼠结合UUO模型,通过免疫荧光染色、原位杂交、特殊染色法和流式细胞术等方法,从动物、细胞及分子水平上研究Notch信号调控EndMT及Notch信号下游miR-342-5p影响肾脏纤维化进程的作用及机制,以期能够为肾纤维化提供新的思路和临床论证。[研究方法]第一部分1.野生型（wild type,WT）小鼠建立UUO模型,通过H＆E、Masson、天狼猩红方法等方法验证模型建造成功与否;2.免疫荧光、肾脏代谢产物检测等观察肾脏细胞凋亡、肾功能生化指标等改变情况;3.流式细胞术（flow cytometry,FCM）分选出UUO及对照肾脏ECs,定量逆转录聚合酶链式反应（Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测EndMT标志基因及Notch信号相关分子表达水平,免疫荧光染色检测组织中EndMT变化情况。第二部分1.将 Cdh5-CreERT2 小鼠与 Rosa26-loxp-Stop-loxp-NIC 小鼠交配,获得 EC 特异性Notch活化遗传修饰的NICeCA小鼠。将Cdh5-CreERT2小鼠与RBPJfloxed小鼠交配,获得EC特异性Notch阻断遗传修饰的RBPJΔE小鼠。聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）技术进行基因型鉴定小鼠基因型。2.在遗传修饰小鼠上建立UUO模型,并通过比较肾重/体重、Masson、天狼猩红特殊染色以及组织免疫荧光染色观察肾脏大小、胶原沉积和EndMT变化情况。3.免疫荧光、肾脏代谢产物检测等观察肾功能生化指标等改变情况;第三部分1.原位杂交、免疫荧光染色、FCM及qRT-PCR检测肾纤维化血管ECs中Notch信号下游miR-342-5p的表达。2.免疫荧光染色观察CKD 3期及以上患者肾活检样本中动脉标志基因的变化。3.Notch信号下游miR-342-5p在不同血流环境中表达不一致。肾纤维化ECM异常堆积导致血流紊乱。[实验结果]第一部分1.成功建立UUO模型。2.WT造模小鼠H＆E染色炎症浸润及细胞凋亡增加,间质胶原沉积增加,呈纤维化改变,且造模2周比1周炎症浸润、细胞凋亡及胶原沉积更明显。3.免疫荧光染色证实肾纤维化进展过程存在EndMT。4.FCM分选纤维化小鼠肾脏ECs,显示ECs数量显著减少,Notch信号相关下游分子表达下调,EndMT相关基因表达上调。肾功能指标在正常值范围内,但是实验组小鼠肾功能指标显著高于对照组小鼠,尿酸、肌酐在纤维化2周显著增加,有统计学差异。第二部分1.NICeCA小鼠建模后EndMT显著减少。胶原沉积无明显改变。2.RBPJΔE小鼠建模后EndMT无明显改变,胶原沉积显著下降,证实阻断Notch信号能够降低纤维化。第三部分1.Notch信号下游miR-342-5p在肾脏血管ECs的动脉中表达,几乎不在静脉表达,且在纤维化肾脏组织血管中表达降低。2.CKD 3期及以上患者肾活检样本中动脉标志基因GJA4呈降低趋势。3.肾纤维化ECM异常堆积导致血流紊乱,而Notch信号下游miR-342-5p在不同血流环境表达不一致。[实验结论]1.在UUO导致的慢性肾纤维化模型中存在EndMT,且Notch信号在纤维化ECs中被抑制。2.NICeCA小鼠中EndMT显著降低,胶原沉积及肾功能无明显变化。而在RBPJΔE小鼠体内EndMT无明显改变,胶原沉积和肾功能指标显著降低,一定程度证实抑制Notch信号能够延缓肾纤维化。3.Notch信号下游miR-342-5p在肾脏血管ECs的动脉中表达,几乎不在静脉表达,且在纤维化动脉血管ECs中表达降低。4.MiR-342-5p在不同血流环境中表达水平不一致。层流剪切力升高,在湍流及涡流中降低。