产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）又称魏氏梭菌（C.welchii）,呈杆状,革兰阳性菌,广泛存在于自然界中,是一种危害性较强的人畜共患病病原体,主要引起人和多种动物的食物中毒,创伤性坏疽或气性坏疽,分泌性、坏死性或者出血性肠炎,肠毒血症,痢疾等。该病具有发病急、病程短、死亡率高的特点,经常会导致动物的急性死亡,对人类健康及养殖业具有较大的威胁。产气荚膜梭菌本身并无侵袭力,致病性主要由其分泌外毒素作用所致。根据4种主要毒素α（CPA）、β（CPB）、ε（Etx）、iota（Cpi）的产生情况将产气荚膜梭菌划分为A、B、C、D、E 5种毒素型。由于产气荚膜梭菌所致的疾病具有发病急、病程短的特点,往往不能及时发现,导致常规药物很难得到理想效果,疫苗是最主要的预防手段。当前广泛使用的疫苗主要为多联苗。这些疫苗主要成分为灭活菌体或者是类毒素或者是将其混合组成,其具有一些缺点如抗原成分复杂,有效抗原成分少,易引起免疫副反应,重组疫苗可能是一个解决方案。已有研究证明表达产气荚膜梭菌α毒素C末端CPA^247-370能够赋予小鼠高的保护率;具有H106P突变的ε毒素(rETX^H106P)的毒性显著降低,且依然具有相当的免疫原性,具有成为基因工程疫苗候选蛋白的潜力;本实验室前期研究证明,β毒素(CPB^108-305)具有多个抗原表位、毒性显著降低,而且诱导的保护水平与灭活β毒素类毒素疫苗无明显差异。鉴于以下三方面的原因:（1）α、β、ε毒素广泛存在于五种毒素型中;（2）产气荚膜梭菌往往是多种毒素联合致病;（3）重组多价毒素保护效力高于单价毒素。因此我们用基因工程手段将这三种毒素(CPA^247-370、CPB^108-305、rETX^H106P)串联表达,预防多种毒素型的感染。在本研究中我们用柔性氨基酸将其串联,成功构建了Cp-abx(CPA^247-370-CPB^108-305-rETX^H106P)。毕赤酵母（P.pastoris）真核系统具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰功能,我们尚不清楚重组融合蛋白Cp-abx(CPA^247-370-CPB^108-305-rETX^H106P)是否存在一些需要修饰的潜在的特殊结构,这些翻译后修饰对于其免疫原性有何影响。此外,大肠杆菌（E.coli）原核表达系统已广泛作为外源基因的表达工具,虽然不具有翻译后修饰功能,但也有诸多优点如表达量高、操作简单。本研究选用毕赤酵母（P.pastoris）真核系统及大肠杆菌（E.coli）原核表达系统来表达Cp-abx(CPA^247-370-CPB^108-305-rETX^H106P)。在体内体外评估了重组蛋白的安全性,发现重组蛋白安全稳定。将两种重组蛋白与弗氏不完全佐剂充分混合作为免疫原免疫小鼠,评价两种重组蛋白的免疫效果,筛选出适合的表达系统。此外,松花粉多糖具有免疫调节作用,在小鼠免疫期间口服松花粉多糖以评价其效果。本实验设计的Cp-abx融合基因序列交由公司分别根据大肠杆菌与毕赤酵母的密码子偏好进行优化后合成。将合成后的基因分别经PCR扩增后克隆到Blunt3载体中,之后转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株并扩增,经PCR与测序鉴定正确之后,用两种内切酶NcoⅠ和XhoⅠ分别将pET-28a（+）空质粒和Blunt3-Cp-abx双酶切,并用T4 DNA连接酶连接并转化到到DH5α感受态细胞进行鉴定,鉴定正确后扩增,提取质粒并用热激法转化到BL21（DE3）感受态细胞中,鉴定正确后命名为pET-28（a）-Cp-abx。同时将空质粒也转入BL21（DE3）感受态细胞中作为阴性对照命名为pET-28（a）-vector。在毕赤酵母中选用pPIC9分泌型表达质粒,融合片段正确连接pPIC9表达质粒之后,用限制性核酸内切酶SacⅠ将其与空质粒进行单酶切线性化,用电转化法转入毕赤酵母GS115感受态细胞中,阳性转化子鉴定正确并命名为pPIC9-Cp-abx。空质粒作为阴性对照,命名为pPIC9-vector。将pET-28（a）-Cp-abx进行扩增,并在对数生长期前加入IPTG进行诱导,分别取诱导后0、1、2、3、4、5和6 h的菌液,4℃离心,收集上清与菌体并超声破碎,发现融合蛋白以包涵体形式存在。同样,将构建好的pPIC9-Cp-abx用甲醇进行诱导表达,并取0、1、2、3和4d的菌液,4℃离心,收集上清与菌体。SDS-PAGE分析表明,在两种表达体系下的蛋白凝胶层析中都出现了分子大小是71.15 kDa的目的条带,Western Blotting印迹分析进一步证明了SDS-PAGE中的目标条带与目标蛋白相对应,且重组大肠杆菌诱导表达后蛋白主要以包涵体形式存在;重组毕赤酵母诱导表达后蛋白主要在上清中,为分泌表达。将表达蛋白进行镍柱纯化,之后再用SDS-PAGE检测,只有71.15kDa单一目的条带。此外,融合蛋白在毕赤酵母中的表达量低于在大肠杆菌中的表达量。将纯化后的蛋白用BCA法测量蛋白浓度后与IFA佐剂等比例混合并搅拌均匀,制成相同浓度的免疫原。将180只5-6周龄SPF小鼠平均分为6组,分别接种pPIC9-Cp-abx;pPIC9-Cp-abx且口服PPPS;pET28a（+）-Cp-abx;pET28a（+）-Cp-abx且口服PPPS;商品疫苗（羊三联四防疫苗）和磷酸盐缓冲液对照组（PBS）。每隔一周免疫一次,连续免疫三周。随后我们检测了抗体水平,外周血淋巴细胞转化率以及外周血CD₄+和CD₈+T淋巴细胞的数目。此外,检测了外周血以及小肠中细胞因子（IL-2,IL-4,IFN-γ）的水平,并用攻毒保护试验评价了重组蛋白的保护效果。实验结果显示,毕赤酵母和大肠杆菌表达的重组蛋白添加佐剂,在免疫期间口服松花粉多糖能够诱导与商品疫苗同等的保护力（100%,6/6）,且显著优于其他组,此外,未口服松花粉多糖的重组融合蛋白组也显示出较高水平的保护率（83.3%,5/6）。本研究将实验室前期筛选出的与β毒素具有相似免疫效果的保护性抗原表位与已有研究证明的α和ε的有效抗原表位进行串联,经密码子优化后分别表达于大肠杆菌和毕赤酵母中,研究证明二者表达出来的蛋白安全无毒,均能诱导机体的免疫保护,对小鼠有显著的保护作用。此外,松花粉多糖具有一定的免疫增强作用,在一定程度上增强了机体的免疫应答。另外,在大肠杆菌中表达的量高于在毕赤酵母中表达的量,而诱导的保护水平无明显差异,这说明毕赤酵母中的一些翻译后修饰并不会显著改变Cp-abx的诱导的免疫保护水平。我们推荐将大肠杆菌作为融合蛋白表达的优选的表达宿主,具有作为预防产气荚膜梭菌疫苗的潜力。本研究为产气荚膜梭菌新型疫苗的研究提供了理论基础。