目的：电刺激是人工控制心脏搏动频率的标准技术，但在实验研究中，这种方法有较大的局限性，如局部电解效应、刺激频率和时长受限、只能对目标范围内的所有细胞进行刺激、不能选择性作用于心肌细胞等。另一方面，实验研究需要获得心肌细胞，传统的心肌细胞分离技术多采用特殊的灌流装置进行逆行大血管灌流来分离心肌细胞，需要的设备要求精密，对分离心肌细胞技术要求过高，需要进行专业培训，有大量需要克服的技术问题，这严重阻碍了实验进程。本研究对基于光遗传学的光控心脏起搏技术进行了实验论证，并且探索了一种更简便易行的心肌分离技术的方法。这在心肌电生理学特别是心律失常研究中有着非常重要的应用价值。
　　方法：1、杂交繁殖转基因小鼠:（1）研究使用的αMHC-Cre转基因小鼠为αMHC启动子驱动的心肌特异性Cre重组酶表达小鼠，ChR2(H134R)-tdTomato转基因小鼠在通用型CAG启动子和ChR2(H134R)-tdTomato融合基因之间插入了两个LoxP位点和STOP终止序列，在没有Cre重组酶的情况下ChR2(H134R)-tdTomato不表达。将两种转基因小鼠杂交后，在心肌细胞中表达的Cre重组酶对两个LoxP位点进行剪切和重组，中间的STOP序列被切除，ChR2(H134R)-tdTomato融合蛋白得以表达。将实验小鼠分为实验组αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+组（8-12周）和对照组：αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+（8-12周）、αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato-（8-12周）；（2）转基因小鼠基因型鉴定；（3）小鼠心脏荧光表型鉴定。2、采用特定频率的蓝光刺激使心肌细胞特异性表达光激活阳离子通道channelrhodopsin-2(ChR2)的转基因小鼠心肌细胞膜电位去极化，从而引发动作电位并控制心脏搏动。3、用一种简便的无需Langendorff灌流的方法分离成年小鼠心肌细胞。
　　结果：1、通过将αMHC-Cre小鼠和ChR2-tdTomato小鼠进行杂交，本研究获得了αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+（心肌特异性表达Cre和ChR2-tdTomato）、αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato-（心肌特异性表达Cre但不携带ChR2-tdTomato基因）和αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+（不表达Cre，携带ChR2-tdTomato基因但由于上游终止序列的存在而无法表达）三种基因型的小鼠。2、(1)转基因小鼠心脏荧光表型：在561nm LED光源的激发下，αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠的心脏发出明亮的红色荧光且在其它部位没有荧光，说明ChR2-tdTomato融合蛋白在该基因型小鼠心脏中具有组织特异性的高水平的表达。在同样条件下，αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+小鼠心脏及其它部位均没有明显的荧光，说明ChR2-tdTomato没有表达。（2）心脏自主搏动小鼠的光控起搏心肌表达ChR2-tdTomato的αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠在连接呼吸机和开胸后，在没有蓝光刺激的情况下，心脏自主搏动的频率约为4Hz；当给予小鼠心脏2Hz的蓝光刺激时，原先的自主搏动节律被打乱，出现明显的心律失常；当蓝光刺激频率与自主搏动频率相同时，心跳频率维持在4Hz；当使用6Hz蓝光刺激频率时，心脏搏动完全由光照支配，且表现为窦性心律；当蓝光刺激频率提高至8Hz时，心跳频率也随之变为8Hz，但出现了短暂的心律失常；当使用10Hz的蓝光刺激时，小鼠心肌已不能承受如此快速的去极化，虽然心脏搏动仍较为规律，但心电图波形已出现严重的紊乱。当蓝光刺激撤除之后，无论之前使用了何种刺激频率，小鼠心脏均可以迅速恢复到4Hz的自主搏动状态。(3)心脏停跳小鼠的光控起搏为了检测因缺血损伤而无法自主搏动的心脏对蓝光刺激的反应，本研究将αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠麻醉后不连接呼吸机直接开胸，待心脏停跳后进行蓝光刺激，发现当刺激频率为1-5Hz时，蓝光刺激可以有效引发小鼠心脏的搏动，搏动频率与刺激频率完全一致。当蓝光刺激频率更高时(7.5-10Hz)，由于可能存在的心肌损伤，小鼠心率仅能维持在4-5Hz范围内，无法进一步提高。以上结果说明光遗传学技术具有起搏停跳心脏的能力，其起搏效果可能与心肌损伤的程度密切相关。(4)对照小鼠对蓝光刺激无响应：为了确认αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠心脏的光控起搏是由心肌表达的ChR2引发的，本研究还对αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato-和αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+两种不表达ChR2-tdTomato的对照小鼠进行了同样的实验，发现两种小鼠对5Hz和10Hz的蓝光刺激均没有响应，心率一直维持在6Hz。(5)分离心肌细胞的光控收缩和ChR2电流记录：蓝光刺激和电刺激均可以引发αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+小鼠心肌细胞的收缩，而αMHC-Cre-/ChR2-tdTomato+小鼠的心肌细胞对光刺激无响应。通过膜片钳技术也记录到了αMHC-Cre+/ChR2-tdTomato+心肌细胞特有的光刺激电流，说明ChR2的表达是心脏光控起搏的决定因素。
　　结论：1.心肌特异性表达光敏感通道ChR2的转基因小鼠可以使用蓝光照射进行心脏起搏，当蓝光刺激频率低于小鼠的自主心脏搏动频率时，蓝光刺激会对窦性心律形成干扰，造成暂时性的心律失常，去除蓝光照射后小鼠心跳恢复正常。2.当蓝光刺激频率等于或高于ChR2表达小鼠的自发心跳频率时，小鼠的心率完全由蓝光刺激支配，去除蓝光照射后恢复到自发搏动状态。3.表达ChR2的小鼠心脏在因缺血损伤失去自主搏动能力后也可由蓝光刺激进行起搏。4.不表达ChR2的对照小鼠心脏在任何情况下对蓝光刺激都没有响应。5.蓝光刺激可以激活小鼠心肌细胞上表达的ChR2通道，产生光电流并引起细胞收缩。6.简便的无需Langendorff灌流分离成年小鼠心肌细胞的方法比起传统的Langendorff灌流方法操作简单且获得心肌细胞状态良好。