肿瘤是一种严重威胁人类生命健康的疾病，其发病率有逐年上升的趋势。在我国，恶性肿瘤则是各种人类疾病的头号杀手。因此，肿瘤学家们一直致力于肿瘤发生、发展过程的研究。目前，人们已经普遍接受了癌基因的激活和抑癌基因的失活可导致癌症发生的理论。70年代，肿瘤学家对遗传性肿瘤进行谱系分析以研究肿瘤基因时，提出了“二步论假说”，并且发现了视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma，RB)中均有RB这种抑癌基因的缺失，由此，肿瘤抑制基因的研究方兴未艾。抑癌基因的存在，是生物界长期进化所形成的一种保护性机制，也正是由于这种保护性机制的存在，才可以使大多数人免受癌症的威胁。 卵巢癌是女性生殖道三大恶性肿瘤之一。由于卵巢位于盆腔深部，发病隐袭，早期无明显症状和体征，就诊时70％已是晚期，所以对卵巢癌的病因进行研究，不仅可以阐明卵巢癌的形成机制，同时也大大有利于保护妇女的生命健康。目前对卵巢癌病因的研究主要归结在遗传因素、环境因素和内分泌因素上。对卵巢癌的遗传学研究也大都集中在对已知单个基因的表达或缺失情况研究，而国内对卵巢癌基因克隆方面的研究非常少。因此，如果用有效的方法分离、克隆卵巢癌相关基因并进行研究，将为卵巢癌的基因诊断和基因治疗奠定基础。 本次实验，我们采用cDNA代表性差异分析(Representational Difference Analysis of cDNA，cDNA-RDA)方法发现并克隆卵巢癌的相关基因，为卵巢癌的基因诊断和基因治疗提供靶基因。 材料和方法 标本选取在中国医科大学第二临床学院妇科行手术切除的卵巢上皮浆液性囊腺癌组织(经病理证实)，选用同一人对侧、经病理证实为正常的卵巢组织为对照，或者选用因其它疾病而切除的一侧正常卵巢组织作对照(经病理证实)。 1．总RNA及mRNA的分离纯化 用TRIzol Reagent(GIBCO BRL公司产品)分离总RNA，用Promega公司Poly AT Tract mRNA Isolation System分离poly(A+)RNA，直接用于合成cDNA第一链。 2.双链cDNA的合成用Promega公司的Univers吐凡boaone cDNASynthesis System合成第一链和第二链eDNA。 3.cDNA一RDA用限制性内切酶DPnn(NEB公司)分别消化卵巢癌侧及对侧正常组织的cDNA，在T4DNA连接酶的作用下连上含有该酶酶切位点的R一24/12接头，然后进行PCR扩增，纯化去除接头并换接头J一24/12，Tester与Drive:按1:100的比例在缓冲液中进行第一轮杂交， PCR扩增产物即是DPI。同上述方法再进行第二、第三轮杂交，比例分别为1:400、1:80，000，接头分别为N一24/12、J一24/12，分别得到DPll、DPlll。 4.转化和测序将DPlll得到的三个片段分别与pMD18(TAKARA公司)载体连接，转化后提取阳性克隆质粒DNA，PCR扩增和限制性内切酶酶切鉴定后将菌样送至上海基康公司测序，并进行互联网同源性比较和分析。 5.RT一PCR验证对包括本实验所用标本在内的共5对配对标本进行RT一PCR验证，证明本实验所得的差异片段是否来源于mRNA水平。结果 1 .cDNA一RDA三轮消减杂交产物 随着消减杂交中Tester与Driver的比例增高，表达差异片段数目逐渐减少，特异性扩增信号随杂交比例的提高而增强。 2.DPlll一1、DPlll一2、DPlll一3结果及同源性分析 测序结果显示DPlll一1、DPlll一2与DPlll一3片段大小分别为17lbp、172bp、233bp，并且DPlll一1与DPIn一2序列相似，可以看成是同一个产物。因特网上进行同源性比较后发现，DPlll一1( DPlll一2)、DPnl一3分别与alphar actin基因、transgehn基因的部分片段高度同源，同源性分别达99%、99%。 3.RT一PCR验证 发现除一对配对标本DPnl一3表达减弱不明显外，其他配对组织的DPlll一1(DPlll一2)和DPlll一3在癌组织中均表达减弱或缺失。讨论一、本次实验之所以在第一轮、第二轮杂交时得到的差异片段集中在200bp一400bp之间，第三轮杂交得到的差异片段集中在200bp一300bp之间，是因为所使用的PCR条件优先扩增小片段(1比)。由Nik01ai utsyn等人提出的RDA法最先用于两高度同源基因组DNA的差异分析，PcR条件优先扩增Ikb的小片段，Hubank等人在RDA的基础上，建立了CDNA-RDA，用于基因表达差异研究。‘因为cDNA的复杂性远远低于基因组DNA，所以无需象RDA那样制备代表性扩增子，又因为所选用的内切酶是识别4个碱基的内切酶，代替了识别6个碱基的内切酶，所以所制备的“扩增子”基本上能代表两组cDNA的信息。从本实验的结果来看，结合动力学富集和PCR扩增技术的RDA法，使得随杂交次数的增加，差异片段越来越富集。 cDNA一RDA技术中，既可以将正常组织来源的扩增子作为Tester，将癌组织来源的扩增子作为Driver，杂交后得到抑癌基因;也可以将正常组织来源的扩增子作为Driver，将癌组织来源的扩增子作为Tester，杂交后得到癌基因。因正常卵巢组织来源有限，故本次实验将正常卵巢组织来源的扩增子作为Tester，得到早期卵巢浆液性癌的抑癌基因。 二、DPlll一1与DPnl一2的cDNA克隆序列稍有不同，但都与已pharactin基因?