背景2013年全国报告的微生物因素所致食源性疾病暴发事件中主要由沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌及其肠毒素等引起,分别占患病人数的26.5%、22.8%和12.0%。2013年全国食源性疾病病例监测,1335家哨点医院和1371个疾病预防控制机构共分离、检测87439份粪便标本,其中沙门氏菌、副溶血性弧菌、致泻大肠埃希氏菌的平均检出率分别为2.83%、1.62%、0.97%。2013年北京市食源性疾病主动监测结果表明：哨点医院共采集腹泻病例标本5617份,检出食源性致病菌阳性菌株954株,其中副溶血性弧菌检出最多,372株,占38.99%。故由副溶血性弧菌导致的食物中毒将是北京今后几年内威胁消费者健康的主要食品安全事件。通常水产品副溶血性弧菌分离株致病性较弱,而腹泻病例分离株致病性较强,与水产品样本分离株毒力基因型差别较大,二者之间关联性研究较少。本文对2014年北京夏季市售水产品污染副溶血性弧菌与食源性感染病例的副溶血性弧菌进行血清型、毒力基因型、耐药谱、分子分型的研究比较,对北京市水产品污染及腹泻病例副溶血性弧菌关联性进行分析。目的了解北京地区市售水产品的副溶血性弧菌污染水平以及哨点医院食源性感染病例的副溶血性弧菌感染情况；通过对不同水产品(海水产品、淡水产品)中副溶血性弧菌的血清型、毒力基因型、耐药谱和分子分型的研究,构建水产品中副溶血性弧菌食品微生物风险评估实验室基础数据库；基于副溶血性弧菌分子分型技术,揭示水产品中副溶血性弧菌污染与病例感染的关联性,为北京地区食源性疾病暴发的致病病原分析提供溯源,为评估食品安全风险监测的目的与意义提供技术支持。方法1.选择北京地区三个大型农贸市场：新发地农产品批发市场、岳各庄农副产品批发市场中心和京深海鲜批发市场,采集不同种类的淡水产品和海水产品,采用MPN方法对样品中副溶血性弧菌进行定量检测,获得各类水产品中副溶血性弧菌的污染率及污染量数据。2.选择北京丰台区中医药大学附属东方医院、北京丰台医院、中国航天科工集团七三一医院作为监测哨点医院,以呕吐或腹泻等消化道症状为主诉的就诊病例作为监测样本。采集上述患者的粪便标本进行副溶血性弧菌的检测,获得食源性感染病例的副溶血性弧菌感染水平。3.采用聚合酶链式反应(PCR)方法对分离得出的水产品株和临床株副溶血性弧菌进行毒力基因t1h、t1h、trh的检测。4.采用玻片凝集的方法对分离得出的水产品株和临床株副溶血性弧菌进行血清学分型。5.参照美国临床与实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推荐的微量肉汤稀释法和MIC解释标准对分离得出的水产品株和临床株副溶血性弧菌进行药物敏感性试验。6.采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法对分离得出的水产品株和临床株副溶血性弧菌进行分子分型的研究,采用Bionumerics分析软件对DNA指纹图谱进行聚类分析,从基因的水平量化不同菌株之间的亲缘关系。结果1.副溶血性弧菌污染率及污染量研究结果显示,2014年7-9月份实际共采集水产品样品164份,其中80份样品中分离到副溶血性弧菌,总污染率为48.78%；淡水产品污染率为38.78%,海水产品污染率为53.04%。淡水产品样品中副溶血性弧菌平均菌量浓度为66.63MPN/g,海水产品样品中副溶血性弧菌平均菌量浓度为36.54MPN/g。80份阳性样品中,有14份菌量浓度>210MPN/g。不同种类水产品中,贝类、虾类的污染率高于鱼类和蟹类；不同月份间,污染率未见明显差别。2.三家哨点医院2014年7月末至8月末的腹泻临床病例中分离出21株副溶血性弧菌。其中,8月份因呕吐或腹泻等消化道症状就诊的患者33名,其中17名患者粪便样本分离出副溶血性弧菌,副溶血性弧菌感染率为51.52%。3.PCR毒力基因检测结果显示,80株水产品来源和21株腹泻病例来源的副溶血性弧菌tlh基因全部阳性,trh基因全部阴性。21株腹泻病例来源的副溶血性弧菌,20株tdh毒力基因阳性,tdh毒力基因携带率为95.24%；80株水产品来源的副溶血性弧菌,只有1株tdh毒力基因阳性,tdh毒力基因携带率为1.25%。4.21株临床病例来源的副溶血性弧菌,除1株不能分型,其余20株中最主要血清型为03：K6型,占总数的61.90%(13/21)；其次为04：K8型,占总数的28.57%(6/21)；还有1株属于02群,K抗原未知。80株副溶血性弧菌0抗原血清分型率高,达到97.5%,分属于9个不同的0群,包括01、02、03、04、05、06、08、010、011。主要血清型集中在02、01、05群,这三种血清型占水产品菌株数的61.25%,02群为最主要血清型,占总数的35.00%。水产品中副溶血性弧菌K抗原分型率低,能完全分型的菌株占总数的37.50%(30/80),其中以02：K28最多,占完全分型菌株数的43.33%(13/30),为发现03：K6型临床流行株。出现3株新菌型,血清型为01：K33、05：K33、011：K34。5.药敏试验结果显示,21株临床来源的副溶血性弧菌只对青霉素类的氨苄西林出现耐药和中介,耐药率为28.57%(6/21),中介率为57.14%(12/21),对其余11种抗生素全部敏感。80株水产品分离株中,有50株菌对至少一种抗生素耐药,总体耐药率为62.50%；10株菌出现双重耐药,双重耐药率为12.50%。其中,对氨苄西林的耐药及中介菌株最多,耐药率达45.00%(36/80),中介率为39.68%；其次是庆大霉素,耐药率25.00%(20/80)；四环素、环丙沙星、萘啶酸、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑耐药率均为1.25%(1/80)；多粘菌素B有5.00%(4/80)的中介菌株,但未出现耐药株。水产品分离株对头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、氯霉素、美罗培南均100%敏感。不同类型水产品中,淡水产品分离株耐药率为52.63%,海水产品分离株耐药率为65.57%,均以氨苄西林和庆大霉素耐药率最高,总体耐药情况无明显差异,但是双重耐药情况绝大多数出现在海水产品分离株中。6.副溶血性弧菌PFGE分子分型结果显示,101株菌经限制性内切酶sfi Ⅰ酶切后显示出良好的分型能力,分型率为96.04%(97/101),共产生92种带型,每株菌条带数在12-22条之间。聚类结果显示,腹泻病例来源的副溶血性弧菌遗传相似度在47.3%-100%之间,可分为4个群(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),相同血清型之间相似度高,有紧密的亲缘关系；水产品来源的分离株遗传相似度在48.3%-97.6%之间,淡水产品分离株和海水产品分离株之间只有少数相似度高,不同类型水产品分离株之间最高相似度为97.1%,样本来自相同时间、相同地点；水产品来源和腹泻病例来源的副溶血性弧菌遗传相似度在48.3%-100%之间,存在3个较明显的克隆群,群内相似度>88.7%,包含6株水产品分离株和11株临床分离株,水产品分离株和临床分离株最高遗传相似度达到100%,不同来源的分离株之间存在紧密的亲缘关系。结论1.北京地区市售水产品贝类、虾类副溶血性弧菌污染率高于其他类水产品,淡水产品和海水产品间存在交叉污染的可能性大。2.北京食源性感染病例中副溶血性弧菌感染率高,不同性别间感染率未见差异。3.80株水产品来源的副溶血性弧菌只有1株菌检出tdh基因,trh基因均未检出,但同期哨点医院腹泻病例粪便样本中分离的21株副溶血性弧菌毒力基因型绝大多数为tdh(+)/trh(一),占95.24%(20/21)。表明水产品副溶血性弧菌分离株致病性较弱,腹泻病例分离株致病性较强,与水产品样本分离株毒力基因型差别较大。4.03：K6和04：K8血清型副溶血性弧菌是导致北京地区副溶血性弧菌感染的优势菌株。水产品来源的副溶血性弧菌血清完全分型率低,主要血清型为02群,发现3株新菌型,其中2株未经报道过。水产品株的02：KUT型和02：K3型具有引起食源性疾病的潜在风险。5.哨点医院腹泻病例来源的副溶血性弧菌对多种抗生素敏感。水产品来源的副溶血性弧菌耐药情况受水产品原产地影响,情况复杂,淡水产品和海水产品分离株耐药情况无明显差异。北京地区尚未发现多重耐药株,但是海水产品中贝类和虾类产品出现了双重耐药株。6.哨点医院腹泻病例来源的副溶血性弧菌PFGE带型集中,所有的03：K6型临床株带型相似度高,亲缘关系紧密,提示病人可能具有相同的感染源。水产品来源的副溶血性弧菌带型较分散,绝大对数淡水产品分离株和海水产品分离株间相似度不高,表明导致淡水产品副溶血性弧菌污染的主要原因并非交叉污染,提示淡水产品和海水产品存在不同的污染源。不同来源的分离株遗传相似度>88.7%的有17株,包含11株腹泻病例分离株和6株水产品分离株,最高遗传相似度达100%,表明超过半数的临床分离株都与水产品分离株亲缘关系密切,提示水产品是导致北京地区夏季副溶血性弧菌食源性感染疾病的高风险食品。