梁山慈竹DfSLR1基因功能研究

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梁山慈竹属禾本科植物,具有纤维含量高、纤维质量好、生物量大等特点,是制浆造纸的优良原料,其含量丰富的纤维素可以转换为众多工业产品。并且,纤维素也是一种可再生的生物能源,绿色环保无污染。利用分子生物学的手段探究纤维素合成机理、研究调控纤维素生物合成相关基因的功能,对竹类植物的遗传改良具有重大意义。赤霉素(GA)是一种重要的植物激素,在调控种子萌发、茎伸长、开花和果实发育等过程中发挥着重要作用,同时,GA信号通路通过降解其抑制因子——DELLA蛋白,来促进植物的生长发育以及细胞壁中纤维素的合成。因此,探究DELLA基因在植物生长中的功能,能够帮助理解纤维素合成的调控机制。本研究基于梁山慈竹转录组数据库,从梁山慈竹叶片中克隆得到一个DELLA蛋白,命名为DfSLR1,序列全长1869bp,编码622个氨基酸。通过对该基因功能的研究,得到了以下结论:(1)生物信息学分析结果显示,DfSLR1的N端含有典型的DELLA蛋白保守结构域,C端含有GRAS结构域,属于更大的一类GRAS转录因子家族,表明DfSLR1也是一个转录因子。系统进化树分析结果显示,DfSLR1与水稻的DELLA蛋白SLR1、玉米的DELLA蛋白D8、d9以及毛竹的DELLA蛋白亲缘关系最近。且不同物种中的DELLA蛋白结构域具有高度保守性。(2)亚细胞定位结果显示,DfSLR1蛋白主要在细胞核中表达。(3)通过染色体步移法克隆得到DfSLR1基因上游2233bp大小的启动子序列,启动子元件分析发现,DfSLR1启动子序列上存在多个启动子核心元件CAAT box和TATA box,具有典型的启动子特征。同时还含有2个干旱响应元件MBS,9个光响应元件Box 4、I-box等,以及13个茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif,1个水杨酸响应元件TCA-element,以及1个生长素响应元件TGA-element。推测DfSLR1与胁迫应答和激素响应有关。(4)组织表达分析结果显示,DfSLR1在检测的不同组织中均有表达,但在侧枝条中表达量最高。梁山慈竹侧枝条经100μM GA、100μM ABA、100μM MeJA以及20%PEG6000胁迫处理后,DfSLR1的表达水平在3h和6h均呈现下降趋势,表达量的变化说明DfSLR1可能参与了干旱胁迫以及GA、ABA、MeJA不同激素信号的调控路径。(5)酵母双杂交结果显示,DfSLR1全长和DfSLR1-N端都具有转录自激活活性,而DfSLR1-C端不具有转录活性。同时,DfSLR1全长能够与DfNAC1和DfNAC2转录因子相互作用,DfSLR1-C端也能够与DfNAC1转录因子相互作用。(6)DfSLR1过表达烟草表型较野生型矮小,茎秆中纤维素含量降低,同时与次生纤维合成相关的NAC和MYB转录因子以及下游纤维素合成酶基因CESA4、CESA7、CESA8表达水平下调。木质素含量升高,同时木质素合成相关基因4CL1和C4H表达水平上调,间苯三酚染色证明DfSLR1过表达烟草茎秆中木质部加宽。表明DfSLR1是烟草生长的负调控因子,且负调控次生壁纤维素的生物合成。通过在1/2MS培养基上对DfSLR1过表达烟草T2代幼苗进行50μM GA3、50μM PAC、50μM ABA、50μM MeJA不同激素以及5%PEG6000干旱胁迫处理,结果显示,DfSLR1能够响应GA信号,GA处理挽救了DfSLR1幼苗的生长抑制表型。并且,GA3、ABA、MeJA以及PEG6000都显著增加了DfSLR1过表达烟草幼苗的相对根伸长比值。(7)为探究长期GA诱导下,DfSLR1对GA的响应,进行了GA3处理梁山慈竹15天后的转录组测序分析。热图聚类分析结果显示,外源GA3处理后,侧枝条中生长素响应蛋白、ABA信号相关基因、乙烯响应转录因子表达水平发生改变。同时,与次生壁相关的NAC和MYB转录因子、糖转运相关的SWEET和SUS基因,纤维素合成酶基因CESA,木质素合成相关基因PAL,4CL,CCR,GA受体GID1基因和GA生物合成GA20ox基因表达水平也发生变化。而SLR1的表达水平与处理前相比未发生明显变化。表明在长期GA诱导下,与这些差异表达基因相比,GA对SLR1的影响较小。相关通路对GA信号的具体响应过程还有待进一步深入研究。本研究对梁山慈竹DfSLR1转录因子进行了功能研究,探讨了DfSLR1在纤维素合成中的调控作用以及对GA信号的响应,为理解纤维素合成机制提供了理论依据。
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