肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是指左右胆管汇合部以上的胆管上皮起源的恶性肿瘤。在临床中表现为潜伏期长,恶性程度高,放化疗抵抗,预后差等。同时,肝内胆管癌在病因和发病机制上研究不是很深入,缺乏明确的分子指标1。流行病学资料显示近三十年来肝内胆管癌的发病率持续上升；与此同时,随着研究的深入,人们对参与ICC发生发展的分子机制也有了更进一步的认识。外显子测序显示P53, KRAS, SMAD4, IHD等是在肝内担管癌中常常突变或激活的基因,对其恶性进程影响重大。PTEN,全称是磷酸酶与张力蛋白同源蛋白。1997年被两个独立的课题组发现和确认,是继P53之后发现的最重要的抑癌基因2,。在多种肿瘤中,磷酸晦与张力蛋白同源蛋白PTEN功能的重要性是因为其缺失,下调或突变而显现出来的。PTEN通过自身脂质磷酸酶活性,拮抗PI3K-Akt-mTOR信号通路,调控细胞多种生理进程,包括：存活,增殖,能量代谢,细胞骨架构建以及细胞习相互识别。因此,调节PTEN表达和功能的机制,在肿瘤发生发展中尤其重要4。值得注意的是,随着对PTEN功能认识的深入,越来越多的研究发现肿瘤中PTEN缺失与否直接关系着对放化疗药物和抑制剂的敏感性,有文章指出PTEN的缺失会导致肿瘤细胞基因组不稳定,这种不稳定性恰好适用于某些药物,从而可以实现以PTEN为基础的个性化治疗。我们的工作正是得到上述研究的启发,开展了PTEN在肝内胆管癌中的功能探索。首先我们通过cDNA测序法检测肝内胆管癌组织,发现PTEN有突变,尽管这随后被证明为PTEN的假基因(PTENp1),但也侧面反应了PTEN真基因的缺失；对PTEN的外显子进行PCR测序发现,ICC细胞系HCCC-9810有外显子的缺失,导致全长PTEN的mRNA不能被转录出来。同时我们通过Western Blot和免疫组化的方法发现PTEN的确在肝内胆管癌组织和细胞系中存在缺失；结合临床资料,我们发现PTEN的表达量与ICC患者的预后相关,高表达PTEN组的患者预后更好。更有意义的是,PTEN的缺失导致它们对于回补PTEN反应性不同：PTEN野生型的ICC细胞发生抵抗,PTEN突变缺失型狗细胞出现死亡：这在基于病人来源的肿瘤异种移植PDX模型中得到很好的验。同时,PTEN缺失的ICC肿瘤对化疗药物吉西他滨(GEM)和小分子抑制剂Bortezomib和Rapamycin更为敏感。实验方法：1、对肝内胆管癌组织和细胞系进行cDNA和基因组外显子PCR扩增后测序,检测是否存在突变；2、用蛋白免疫印迹法和免疫组化检测肝内胆管癌组织和细胞系中PTEN表达情况；3、统计和分析127例ICC肿瘤组织的石蜡切片PTEN免疫组化结果：4、检测肝内胆管癌细胞系HCCC-9810和RBE增殖迁移能力；观察两种细胞对恢复PTEN表达的反应；用流式细胞技术检测处理后的细胞活力和细胞凋亡；加入Akt抑制剂LY294002,凋亡抑制剂z-VAD,坏死抑制剂Necrostatin1后检测细胞变化情况。5、基因芯片分析两种细胞系PTEN过表达后的基因变化；用Western Blotting检测PTEN过表达影响的信号通路；6、在ICC肿瘤细胞系RBE和HCCC-9810中过表达PTEN,检测细胞内泛素化水平；在HEK-293T细胞中共转HA标签的泛素和PTEN的质粒,检测细胞内泛素化水平。7、用溶酶体探针Lysotracker和外转GFP-LC3质粒检测RBE和HCCC-9810细胞过表达PTEN的自噬-溶酶体变化情况；8、在RBE和HCCC-9810细胞系中加入蛋白酶体抑制剂MG132和自噬激活剂Rapamycin,检测细胞存活情况;9、在RBE和HCCC-9810细胞中过表达PTEN后,加入不同信号通路的抑制剂,检测细胞的存活情况。10、在人源肿瘤异种移植PDX模型中,瘤内注射PTEN腺病毒,检测PTEN对于ICC肿瘤的治疗作用；另外,在该动物模型中腹腔注射吉西他滨(GEM),检测不同PTEN背景ICC肿瘤的反应性。实验结果：1、PTEN在ICC肿瘤组织和细胞系中存在突变；2、PTEN表达量在部分ICC肿瘤组织和细胞系中发生缺失和下调：在ICC细胞系中,RBE为PTEN野生型,HCCC-9810为PTEN缺失型；3、PTEN的表达和ICC患者预后存活相关,PTEN表达高组的患者中位无富存活时间和中位总体存活时间更长；4、RBE和HCC-9810细胞系在增殖迁移等基本生命过程中差别不大;但是当回补PTEN后,HCCC-9810出现死亡,且不完全依赖于PI3K-Akt信号通路的抑制；RBE细胞对于PTEN回补反应性不大。5、基因芯片显示HCCC-9810细胞PTEN过表达后细胞周期和DNA复制受到抑制,同RBE相比,HCCC-9810细胞中溶酶体功能上调,泛素—蛋白酶体功能卜调是比较特异的、可能导致死亡的原因；Western Bloting也显示同样的结果。6. HCCC-9810细胞过表达PTEN后,泛素化水平降低;该过程依赖PTEN的酶活性,包括质粒磷酸酶和蛋白磷酸酶活性。7、在ICC细胞系中,PTEN能够激活溶酶体功能,促进细胞自噬,该过程不完全依赖其酶活性。8、在HCCC-9810细胞中,同时激活自噬和抑制泛素-蛋白酶体功能,将会导致其死亡,而RBE中无明显变化。9、CQ(溶酶体抑制剂),Sal (PERK抑制剂,抑制ER stress), Necro (RIP3抑制剂,抑制细胞坏死),z-VAD (Caspase抑制剂,抑制细胞凋亡)对PTEN介导的9810细胞死亡有一定的拮抗作用。10、PDX模型中,PTEN野生型的ICC肿瘤对PTEN腺病毒介导的治疗效果不佳,而PTEN缺失型ICC肿瘤则有很好的治疗效果；同时,吉西他滨对PTEN缺失的ICC肿瘤治疗效果良好。实验结论：研究中我们发现,PTEN在肝内胆管癌中突变,这种突变将导致蛋白表达映失；PTEN的表达影响ICC肿瘤患者的预后,PTEN高表达组的患者预更好；PTEN通过激活溶酶体,促进自噬,抑制泛素-蛋白酶体信号通路,引发内质网立急等生物学过程导致PTEN缺失型的ICC肿瘤死亡：用小分子抑制剂诱发上述过程也能治疗PTEN缺失型的ICC肿瘤；而PTEN野生型的ICC肿瘤则抵抗上述效应。PTEN缺失型的ICC肿瘤对吉西他滨(GEM)更为敏感,PTEN野生型的肿瘤反应性差。因此,PTEN可以作为肝内胆管癌个性化治疗的靶标,指导临床用药(化疗药物、小分子抑制剂等)；同时,回补PTEN也是缺失型ICC中肿瘤良好的治疗策略。