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目的:川芎嗪在川芎中的存在是一个具有争议性的问题,本研究旨在从川芎内生枯草杆菌代谢产物途径初步探索中药川芎中川芎嗪的来源问题,并对川芎中发挥活血化瘀的药效学作用进行初步探索。方法:(1)采用UPLC-PDA/UPLC-Q-TOF-MS对鲜川芎及川芎药材,进行六种成分阿魏酸、川芎嗪、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、藁本内酯的定性及定量测定,流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水,采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm);(2)川芎中内生枯草杆菌的分离和鉴定。采集四川省彭州市川芎种植基地的鲜川芎,并将其作为分离源。利用组织研磨法分离内生细菌,对疑似枯草杆菌的细菌进行平板划线培养至单一菌落,采用枯草杆菌12项生理生化指标,筛选分离的菌株筛选,并采用16S rRNA技术对菌株进行鉴定;(3)内生枯草杆菌的营养发酵特性研究。采用YPG培养基,摇床转速220 rpm,恒温37°C,连续培养144 h。每12 h于超净工作台中取样一次,用于测量培养液中活菌数、残糖含量、代谢产物含量(川芎嗪、2,3-丁二醇、乙偶姻)、发酵液的PH,绘制曲线图,对其发酵特性进行表征;(4)川芎药材基质培养基固态、液态发酵实验。将川芎药材打碎至过三号筛,川芎固态培养基按照川芎药材粉末29%和71%的无菌水比例制备,湿热灭菌(121°C,30 min);川芎液态培养基按照是否添加磷酸氢二铵分为磷酸氢二铵组(Chuanxiong Rhizoma-Diammonium hydrogen pHospHate,CRD)和非磷酸氢二铵组(Chuanxiong Rhizoma,CR)。CRD培养基的配方为60 g川芎粉,1000 mL无菌水,2 g K2HPO4,2 g KH2PO4,10 g(NH4)2HPO4,PH 7.0-7.2,CR培养基除不加(NH4)2HPO4外与CRD相同;将内生枯草杆菌分别接种至固态、液态培养基中,空白组不接种内生枯草杆菌。固态发酵培养条件为37°C恒温培养箱培养30 d,液态发酵培养条件为摇床220 rpm,37°C条件下发酵培养144 h。两种方式发酵结束后,均采用UPLC/UPLC-Q-TOF-MS测定川芎药材基质固态、液态发酵代谢产物;(5)川芎活血化瘀药效学研究。以肾上腺素合冰水浴造SD大鼠急性血瘀模型,设置阿魏酸组、川芎嗪组、川芎挥发油组、川芎醇提液、阳性药组,模型组、正常组,预防给药7 d,末次给药30 min后取血检测各组血常规及血流变、凝血系统指标。结果:(1)UPLC/UPLC-Q-TOF-MS均未在川芎、鲜川芎中检测到川芎嗪,本实验中川芎嗪的检测限为0.1 ng·g-1。洋川芎内酯H、阿魏酸、洋川芎内酯I、藁本内酯和洋川芎内酯A均可在川芎、川芎鲜药材中测到,川芎药材中各成分的含量分别为洋川芎内酯H 0.3144 mg·g-1、阿魏酸0.8770 mg·g-1、洋川芎内酯I 2.028 mg·g-1、洋川芎内酯A 7.662 mg·g-1和藁本内酯12.88 mg·g-1;鲜川芎中、洋川芎内酯A 0.4512mg·g-1、阿魏酸0.2785 mg·g-1、藁本内酯30.89 mg·g-1。(2)从新鲜川芎根状茎中分离得到五株内生枯草杆菌,分别为:LB3、LB3-2-1、LB4、LB5、LB6-2,五株菌内生菌革兰氏染色阳性,具有芽孢,甲基红反应阴性,V-P反应阳性,经16SrRNA比对后发现与枯草杆菌具有99.99%的同源性。菌种保存于广东省微生物所和中国工业微生物菌种保藏管理中心。(3)营养发酵的GC/GC-MS检测结果显示,五株内生枯草杆菌均能代谢产生川芎嗪,分别为LB3 2.091 g·L-1,LB3-2-1 1.092 g·L-1,LB4 0.8034 g·L-1,LB5 0.7446 g·L-1,LB6-2 1.773 g·L-1五株内生枯草杆菌经过发酵144 h后,以LB5产川芎嗪产量最高,达10.6945 g·L-1。(4)UPLC/UPLC-Q-TOF-MS检测川芎固态发酵培养基代谢产物,除空白组外,五种川芎内生枯草杆菌组均产生川嗪(LB3 235.2μg·g-1,LB3-2-1 188.2μg·g-1,LB4259.0μg·g-1,LB5 909.3μg·g-1,LB6-2 215.8μg·g-1),且除空白组外,各组中均检测到川芎嗪的生物合成前体物质乙偶姻(LB3 70.18μg·g-1;LB3-2-1 61.29μg·g-1;LB460.70μg·g-1;LB5 262.8μg·g-1;LB6-2 67.22μg·g-1);(5)UPLC/UPLC-Q-TOF-MS检测川芎液态发酵培养基代谢产物,CR培养基中经检测到乙偶姻,没有检测到川芎嗪;CRD培养基中,除空白组,各内生菌组均代谢产生川芎嗪和乙偶姻。其中CR组的乙偶姻产量分别为LB3 9.690μg·g-1,LB3-2-114.81μg·g-1,LB4 14.88μg·g-1,LB5 15.36μg·g-1,LB6-2 14.63μg·g-1;CRD组中乙偶姻的产量为:LB3 151.18 mg·mL-1,LB3-2-1 127.79 mg·mL-1,LB4 168.73 mg·mL-1,LB5 142.64 mg·mL-1,LB6-2 123.4 mg·m-1。CRD组中川芎嗪的产量为:LB3 0.2054mg·mL-1,LB3-2-1 0.2869 mg·mL-1,LB4 0.4814 mg·mL-1,LB5 1.027 mg·mL-1,LB6-20.3427 mg·mL-1。(6)与正常组比较,模型组各切变率下全血黏度与血浆粘度显著升高,血沉、压积、红细胞变形指数明显升高;FIB显著升高,PT,APTT明显缩短。与模型组比较,阳性组、挥发油组、川芎组、川芎嗪组能显著降低血液流变学各指标,显著降低FIB含量,显著延长PT和APTT。阿魏酸组对各指标的改善效果不明显。这在一定程度上提示,川芎嗪、川芎挥发油均可对血瘀大鼠的血液流变学及凝血功能异常具有显著改善作用;阿魏酸组药效不明显,可能是由于灌胃给药方式造成的肝肠效应导致。结论:川芎嗪在川芎中的含量低微,不适宜作为川芎药材的质量控制性成分;营养发酵条件下,川芎内生枯草杆菌可产生大量的川芎嗪,具有较高的代谢产川芎嗪的能力。川芎内生枯草杆菌可利用川芎药材粉末作为碳源、氮源合成川芎嗪,这从体外角度初步说明,川芎嗪来源于川芎内生枯草杆菌与川芎药材之间的相互作用。川芎中的内酯类化合物及阿魏酸可能是川芎发挥活血化瘀的物质基础。