结核病(Tuberculosis)是由结核杆菌(MycobacteriumtuberculosisM.tb)感染所致的对人类健康危害最大的慢性传染病。世界上约有1/3的人感染了结核，每年约8百万人发病，2百万人死亡。结核病是发展中国家和发达国家的重要的公共卫生问题。在我国，结核患病率在世界上占第二位。目前有结核病人450万，其中传染性病人150万，现在每年新发145万，死亡数13万，农村占80％。如不防治，在今后10年，每年将新发2000-3000万。另外，多种药物抗性结核菌株出现，在上海起始耐药菌达35.2％，四川达47.8％，各省续发耐药率达60-80％，结核问题日益严重。再加上此病易伴发HIV感染，对人类的威胁更加严重，因此，控制结核病的流行实在必需。 疫苗是控制传染病流行最有效和最经济的手段。现在使用的预防结核的疫苗是卡介苗(BacilleCalmette-GuerinBCG)，由减毒的活牛结核杆菌制成。调查发现BCG对肺结核的保护作用很不稳定，它是现在所用的疫苗中最有争议者之一。英国报导BCG的儿童发病保护率为77％，印度报导成人发病保护率为零。另外，由于BCG是减毒活菌，本身有致病和毒力恢复的潜能，对免疫力低下的个体尤其如此。所以，WHO建议AIDS病人不能用BCG。鉴于BCG的这些缺点，急需寻找抗结核的其他疫苗。 一般认为，病原菌的致病物质，与生存以及诱导机体免疫反应有关的成分是疫苗最佳候选分子。结核杆菌感染所致的损伤主要是以结核结节为特征的免疫病理变化。原发感染时，细菌在肺部缓慢繁殖，引起轻微炎症。4-8周后，波及局部淋巴结，CD4+T细胞被激活，产生γ-干扰素(InterferongammaIFN-γ)，活化巨噬细胞，以杀伤结核杆菌。T细胞的持续活化导致结核肉芽肿的形成。因此，可激活T细胞而引起结核结节形成的成分被认为是极好的疫苗候选分子。 结核肉芽肿包绕着结核杆菌，防止其扩散，同时也阻止宿主杀伤因子的进入。在结节内由于坏死造成浸润的巨噬细胞死亡，形成缺氧环境。结核杆菌在此环境中存活，主要靠脂肪酸代谢提供碳源。因此，结核杆菌中参与脂肪酸代谢的酶可作为疫苗候选分子。 研究表明，致病性结核杆菌氧化脂肪酸的能力与它们在宿主体内的生存能力有关。乙醛酸旁路中异柠檬酸裂解酶的编码基因icl突变后可以降低结核分枝杆菌在巨噬细胞内的持续生长。乙醛酸旁路是结核杆菌脂肪酸代谢的唯一通路，草酰乙酸(Oxaloacetate“OAA”)是乙醛酸旁路的下游产物。磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvatecarboxykinsse“PEPCK”)催化草酰乙酸脱羧向磷酸烯醇型丙酮酸(Phosphoenolpyruvate“PEP”)的转化，如果PEPCK的功能丧失会使OAA聚集，进而影响乙醛酸旁路，导致脂肪酸代谢受阻。美国康乃尔大学的一项研究发现，如果将牛结核分枝杆菌BCG中乙醛酸旁路下游的编码磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(PEPCK)的pckA基因从基因组中敲除，pckA基因变异的BCG与野生型BCG相比，在巨噬细胞内的生存能力降低，易于被杀灭。所以，PEPCK作为抗结核疫苗候选分子具有极大的潜力。为了进一步了解结核杆菌PEPCK是否为结核杆菌所必需的成分及其引起的免疫反应机制，本实验研究了敲除了pckA基因的BCG的致病能力，引起机体的免疫反应的变化；应用分子生物学的方法表达、纯化了重组融合蛋白PEPCK，并进行了鉴定；同时应用重组的PEPCK免疫小鼠，通过对淋巴细胞及其活性、细胞因子等免疫指标的检测，鉴定了其免疫原性和抗原性，并初步研究了它对小鼠的保护作用；本研究还将PEPCK用于检测结核病人血清，鉴定了其诊断价值。 本研究完成的主要工作及取得的实验结果： 1.敲除pckA基因的BCG引起的病理变化及引起机体免疫反应的检测：用BCG-WT和BCG△pckA分别感染BALB/C小鼠，对小鼠的肺脏、脾脏和肝脏进行组织学检查，发现pckA基因变异的BCG株感染的小鼠体内产生的结核结节比BCG野生型的结核结节数量少，感染度轻，结节不典型；通过对小鼠T细胞和细胞因子的检测发现用BCG-WT感染的小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞和CD4+/CD8+均高于用BCG△pckA感染的小鼠(P＜0.05)，而且BCG-WT感染的小鼠脾细胞产生的细胞因子如IFN-γ、IL-12、TNF-α也明显高于BCG△pckA感染的小鼠。 2.重组融合蛋白PEPCK的表达：根据结核分枝杆菌pckA基因开放读码框架设计引物5-CGCCATATGACCTCAGCGACCATCCC-3和5，-CGCCTCGAGCTAACCTAGGCGCTCCT-3。用此引物对结核杆菌H37Rv染色体DNA进行PCR扩增，用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，把PCR扩增产物克隆到以pET为基础的质粒p6HisF-11d中的T7启动子下游。建成pHF/pckA质粒。用此质粒转化HB101大肠杆菌，表达出重组融合蛋白PEPCK。SDS-PAGE分析显示，表达的重组蛋白为72KDa，与理论预测的PEPCK分子量大小一致。 3.重组PEPCK的纯化、复性及鉴定：用亲和层析的方法将表达的重组PEPCK纯化，并进行浓缩、复性。Westernblot分析显示，表达的重组蛋白能够被小鼠抗野生型BCG血清识别，表明pckA基因在体外表达的PEPCK与结核杆菌自然的PEPCK结构一致，并具有反应活性。 4.免疫小鼠：用表达的重组融合蛋白PEPCK免疫BALB/C小鼠，每隔两周免疫一次，共免疫三次。第三次免疫两周后，杀死部分小鼠，取其脾脏观察，可见实验组小鼠脾脏明显增大并粘连；取脾脏淋巴细胞用流式细胞仪检测小鼠T细胞，发现实验组小鼠的CD4+T淋巴细胞和CD4+/CD8+均高于用对照组；用ELISA法检测小鼠血清中的细胞因子IFN-γ、IL-12、TNF-α，结果显示实验组小鼠的IFN-γ、IL-12、TNF-α明显高于对照组(P＜0.05)；小鼠血清抗体检测发现，血清抗PEPCK抗体滴度可达到1∶1280甚至以上。用MTT法进行淋巴细胞增殖实验发现实验组小鼠淋巴细胞的刺激指数(SI)明显高于对照组，表明实验组小鼠的淋巴细胞活性明显增高。 5.用PEPCK第三次免疫小鼠两周后，用BCG-WT感染各组小鼠，每只小鼠感染的菌量为1×106个细菌。感染后在不同的时点杀死小鼠，取其脾脏，研碎，取上清铺于固体MB培养基，计数产生的菌落数量。结果显示，PEPCK免疫组产生的菌落数量明显少于佐剂组，这表明PEPCK能够有效的刺激机体产生免疫反应，可以有效的抵御结核杆菌感染或降低感染程度，对机体产生保护作用。 6.用重组PEPCK检测结核病人血清中抗PEPCK抗体，研究了PEPCK对于结核病的血清学诊断价值：到结核病医院收集结核病人血清，用重组PEPCK通过ELISA法检测结核病人血清，在排菌的肺结核病人中阳性率为32.5％，不排菌的肺结核病人中阳性率为12.9％，总的阳性率为17.3％，检测正常人血清的特异性为95％。 本研究利用分子生物学和免疫学的方法首次探讨了结核杆菌pckA基因及其表达的PEPCK的功能，研究表明结核杆菌PEPCK是一种免疫保护性抗原，能够刺激机体产生强烈的免疫反应，尤其是细胞介导的免疫反应，有很好的免疫原性和抗原性。