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肝衰竭的发生机制尚不十分清楚,阐明肝衰竭发病机制,采取早期干预措施减轻肝脏炎症,对进一步治疗肝衰竭以及降低其"病死率"具有重要意义。肝衰竭时,巨噬细胞释放的趋化因子和促炎细胞因子在炎症重症化中起着重要作用。在炎症早期释放的MIP-2,趋化激活中性粒细胞到炎症部位,激活的中性粒细胞释放大量蛋白水解酶造成肝细胞进一步坏死加剧;而到炎症晚期巨噬细胞主动释放重要晚期致炎因子高迁移率族蛋白1(HMGB1),则使炎症重症化发生炎症细胞因子风暴。本课题旨在使用LPS活化巨噬细胞,探索炎症早期巨噬细胞释放的趋化因子MIP-2,在炎症晚期炎症重症化过程中的作用,并进一步研究其机制。本论文分为以下三个部分:第一部分mip-2 siRNA序列的筛选目的 体外筛选最优mip-2 siRNA序列,并研究其作用。方法 不同剂量LPS处理RAW264.7细胞,在0-24小时不同时间点提取细胞总RNA,用RT-PCR检测RAW264.7细胞中mip-2 mRNA的相对表达水平,确定较优剂量。不同序列siRNA处理24h后,使用最适LPS剂量处理RAW264.7细胞2h,提取细胞总RNA,用RT-PCR检测RAW264.7细胞中mip-2和HMGB1 mRNA的相对表达水平,确定干扰效果最优siRNA序列。选出最优siRNA序列,干扰RAW264.7细胞后再用LPS处理2h,提取细胞总RNA,用RT-PCR检测RAW264.7细胞中促炎细胞因子 IL-6、TNF-α、IL-1β、iNOS、CCL2、TLR4 以及 HMGB1 的mRNA相对表达水平;取细胞培养上清,ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白表达水平;RAW264.7细胞经干扰后再用LPS处理24h,提取细胞总RNA和总蛋白,并用RT-PCR及Western Blot试验检测HMGB1蛋白表达。结果 1、在不同的LPS剂量范围内,暴露于LPS的RAW264.7细胞中mip-2 mRNA相对表达与LPS剂量呈剂量效应关系;2、不同序列干扰序列处理24h后,使用0.25μg/mL最适剂量LPS处理Raw264.7 细胞 2h 或 24h,用 RT-PCR 检测 RAW264.7 细胞中 mip-2 和 HMGB1 mRNA的相对表达水平,确定si5为干扰效果最优siRNA序列;3、mip-2 siRNA能显著降低暴露于LPS的RAW264.7细胞培养上清中IL-1β、TNF-a和IL-6蛋白表达水平,且呈剂量依赖性;4、mip-2 siRNA能显著降低暴露于LPS的RAW264.7细胞培养上清中IL-6、TNF-α、IL-1β、iNOS、CCL2 的 mRNA 表达水平;5、mip-2 siRNA显著减少HMGB1的mRNA和蛋白以及TLR4 mRNA水平的表达。结论 1、0.25μg/mL剂量LPS为最佳剂量;2、标记为si5的干扰序列为最优干扰序列;3、mip-2 siRNA能阻断LPS诱导RAW264.7细胞的炎症效应;4、HMGB1表达下调是mip-2 siRNA的作用机制之一;5、mip-2 siRRA也可影响HMGB1-TLR4通路。第二部分 MIP-2抗体减轻炎症作用,并通过PI3K/AKTs、JAK/STAT3和P38-MAPK信号通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞HMGB1的释放。目的研究MIP-2抗体的抗炎作用及机制。方法 同时经MIP-2抗体或不经MIP-2抗体处理的RAW264.7细胞,暴露于0.25μg/mL剂量LPS 24小时后,后用ELISA法测定细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平,用Western Blot试验检测细胞中HMGB1的蛋白表达以及PI3K/AKTs、JAK/STAT3和MAPKs信号通路蛋白磷酸化水平的比率表达;使用PI3K/AKTs、JAK/STAT3和MAPKs信号通路抑制剂处理RAW264.7细胞2h后,再暴露于0.25μg/mL剂量LPS24小时,后用ELISA法测定细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平,并用Western Blot试验检测细胞中HMGB1蛋白表达;将RAW264.7细胞暴露于0.25μg/mL剂量LPS,在0-36h内分别使用HMGB1蛋白抑制剂EP处理RAW264.7细胞,36h后用ELISA法测定细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平;此后再暴露于0.25μg/mL剂量LPS,在一定时间范围内使用MIP-2抗体处理RAW264.7细胞,之后用ELISA法测定细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1蛋白表达水平。结果 1、MIP-2抗体能显著减少细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平;2、MIP-2抗体显著减少细胞中HMGB1的蛋白表达且呈计量依赖性,以及PI3K/AKTs、JAK/STAT3、p38-MAPK信号通路蛋白磷酸化水平的比率;3、PI3K/AKTs、JAK/STAT3和p38-MAPK信号通路抑制剂显著减少细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平以及HMGB1蛋白表达;4、RAW264.7细胞在LPS处理后6h内加入MIP-2抗体能显著减少细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IL-1β、HMGB1蛋白表达水平。结论 1、MIP-2抗体拮抗LPS引起RAW264.7细胞炎症应答;2、下调HMGB1表达是MIP-2抗体抗炎机制之一,这与PI3K/AKT、JAK/STAT和MAPKs信号通路有关;3、LPS处理后6h内加入MIP-2抗体,能起到抑制RAW264.7细胞炎症反应的作用。第三部分小鼠源性重组MIP-2蛋白促炎作用的体外研究目的研究小鼠源性重组MIP-2蛋白促炎作用。方法 RAW264.7细胞经30ng/mL浓度的小鼠源性重组MIP-2蛋白处理2小时,再经LPS处理24h,后用ELISA法测定细胞培养上清中TNF-α IL-6、IL-1β蛋白表达水平;RAW264.7细胞经30ng/mL浓度的小鼠源性重组MIP-2蛋白处理2小时,再经MIP-2抗体或不经MIP-2抗体处理24h,后用ELISA法测定细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平,并用Western Blot试验检测HMGB1的蛋白表达。结果 1、MIP-2重组蛋白能显著升高经LPS处理的细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平;2、MIP-2重组蛋白能显著升高细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平;3、MIP-2重组蛋白能显著升高细胞HMGB1蛋白的表达。结论 1、MIP-2重组蛋白能增加LPS引起的RAW264.7细胞炎症应答;2、MIP-2重组蛋白引起RAW264.7细胞炎症应答;3、MIP-2重组蛋白促炎作用与增高细胞HMGB1蛋白表达有关。