论文部分内容阅读
δEF1 (δ-crystallin enhancer-binding factor 1)隶属于一类转录因子超家族。体内、体外研究结果显示,δEF1具有广泛的转录抑制功能。本实验室前期研究发现,在乳腺癌EMT (epithelial-mesenchymal transition)过程中,δEF1可以通过与E-cadherin启动子序列中特定的反应元件(E2-box)直接结合而实现转录抑制作用,BMP-6通过抑制δE目的表达而间接激活E-cadherin转录,表明在乳腺癌细胞中δEF1受到BMP-6的调控从而参与乳腺癌细胞EMT。但是到目前为止,有关BMP-6调控δEF1转录的分子机制未见报道。此外,已有研究表明,TGF-β等生长因子具有调控EMT和/或E-cadherin表达的功能,TGF-β可以通过调控δE目的表达来进一步影响下游信号通路。本文拟在前期研究基础上,深入探讨在乳腺癌细胞中BMP-6和TGF-β调控δEF1转录的分子机理。
为此,本文以人乳腺癌细胞系MCF-7为模型,构建了五个不同截短长度的野生型人δEF1(-2381～-215)启动子-荧光素酶报告基因质粒,分别与pCDNA3-BMP2/6共转染至MCF-7细胞中,荧光素酶活性检测各启动子活性。继而选用受BMP-6调控显著的野生型δEF1启动子(-522～-215)为研究对象,采用定点诱变法对该段启动子上的AP1结合位点进行突变,构建了该位点突变型的δEF1启动子(-522～-215)-荧光素酶报告基因质粒(pGL3-m0.5)。将野生型δEF1启动子(-522～-215)-荧光素酶报告基因质粒(pGL3-0.5)和突变型δEF1启动子(-522～-215)-荧光素酶报告基因质粒(pGL3-m0.5)分别与pCDNA3-BMP2/6共转染至人乳腺癌细胞系MCF-7,通过荧光素酶活性分析检测启动子活性,判定AP1在BMP6对δEF1转录调控中所起作用。采用TGF-β分别刺激瞬时转染δEF1不同截短长度启动子-荧光素酶报告基因质粒的MCF-7细胞系,及瞬时转染突变型的δEF1启动子(-522～-215)-荧光素酶报告基因质粒(pGL3-m0.5)的MCF-7细胞系,初步探讨TGF-β对δE目的转录调控作用。
研究发现：[1]BMP-6对δEF1不同截短长度的启动子都具有转录抑制作用。δEF1启动子(-522～-215)中AP1结合位点的突变可以有效地减弱BMP-6对该启动子的转录抑制作用；[2]TGF-β对δEF1各个长度的启动子均有不同程度的转录激活作用,TGF-β刺激AP1结合位点突变的启动子,荧光素酶活性与野生型相比无显著变化。
因此,在乳腺癌细胞中,BMP-6对δEF1启动子的转录抑制作用可能是通过该启动子上的AP1结合位点来介导的。BMP-6可能通过MAPK/AP1信号通路实现对δE目的转录调控作用,从而参与乳腺癌细胞EMT的过程。TGF-β在调控乳腺癌EMT中所起的作用与BMP-6相反,它可以激活δEF1启动子的活性,并且该过程也有可能是由MAPK/AP1信号通路介导的。