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蛋白激酶C α相互作用蛋白(PICK1)是蛋白激酶Cα(PKC α)的靶蛋白之一，也是衔接PKC α和膜上众多受体的关键蛋白之一。PICK1在人和动物的细胞或组织内均可表达，以大脑和睾丸中表达最高，肺中最低。在许多细胞中，PICK1一般存在于细胞质中，常富集于核周区，且是不对称分布，多半是在靠近粗面内质网和高尔基体。小鼠来源的PICK1由416氨基酸残基组成，在其N-端含有PDZ结构域(PSD95 Discs large and Zol)， C端区域为一个BAR结构域(Bin/amphiphysin/RVS)，靠近C末端又含一个酸性氨基酸区。PICK1蛋白的结构是非常独特的，目前在NCBI数据库中未发现类似的同时含PDZ结构域和BAR结构域的蛋白。已报道的PICK1的配体的作用区大多集中在其PDZ结构域部分，该结构域和受体蛋白、转运蛋白、衔接蛋白均有相互作用。BAR结构域参与了和GRIP蛋白以及膜的结合。然而，PICK1和这些膜蛋白的相互作用的作用机理与生物学意义还不是很清楚。本研究对PICK1蛋白及其BAR结构域和PDZ结构域分别进行了基因克隆和表达以及产物纯化，并对其部分理化性质进行研究。
根据报道的PICK1基因序列，设计PCR引物，以重组质粒pRK5-pickl为模板，经PCR扩增获得PICK1基因，克隆到pET32M和pGEX-6p-1载体中，并在E.coli BL21中进行表达。重组子pET--pickl表达产物为不溶性包涵体，而重组子pG-pickl表达产物为可溶性融合蛋白GST-PICK1，经GST-Sepharose 4B亲和层析和PreScissionProtease(PPase)蛋白酶切割，以及Sephacryl S-200凝胶层析等，获得了游离的电泳纯PICK1蛋白，经SDS-PAGE分析，其单体分子量约为50 kDa。分子排阻层析和天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，重组PICK1蛋白在溶液中主要以二聚体形式存在，分子量约为103kDa。鉴于PICK1分子含有一个色氨酸残基，我们通过荧光实验初步分析了PICK1蛋白与钙离子的结合特性，随着Ca<2+>浓度的增加，PICK1的内源荧光强度逐渐下降，经计算Ca<2+>与PICK1的结合比为2:1，因此PICK1蛋白和钙离子之间有结合作用。
将BAR(128-360aa)结构域基因读框克隆到含不同启动子的表达载体中(pE32M，pGEX-6P-1，pHGB，pMAL-p2X)中，并在E.coli BL21(pE-bar，pG-bar，pH-bar)或E.coli JM109(pM-bar)中进行表达，目的蛋白大多数以不溶性包涵体形式表达，只有pM-bar在E.coli JM109中获得可溶性表达产物MBP-BAR，表达量可达到细胞总蛋白的30％。但由于Factor Xa蛋白酶价格昂贵，且对MBP-BAR的酶切效果不理想，我们将pMAL-p2X载体中编码识别Factor Xa蛋白水解酶的位点替换为识别PPase酶切位点，构建的修饰载体为pMAL-s。然后截取除PDZ结构域外的不同长短的编码序列(含BAR基因)克隆到新载体pMAL-s中进行表达，并比较了PPase对MBP的拆除效率、酶切后的游离BAR结构域的稳定性以及相应工程菌生长状况等因素，最终选择BARc(128-416aa)(以下简称BARc)进一步制备不含亲和臂的游离BARc样品。酶切后的MBP和BARc蛋白混合物，经1mol/L(NH<,4>)<,2>SO<,4>沉淀，MBP蛋白留在(NH<,4>)<,2>SO<,4>上清中，而BARc沉淀析出得以分离。重新溶解的BARc结构域，经SDS-PAGE分析，其纯度达95％左右。利用Pre-packed Sepharose 12分子排阻层析BARc洗脱的保留体积处于空体积(Void volume)范围，表明BARc为多聚物。以牛脑的脂类提取物作为基质，利用蛋白质-脂类覆盖法(Protein Lipid Overlayassay，PLO)研究游离的BARc与脂类的相互作用，表明BARc结构域与脂类存在特异性结合。同时CD谱也揭示随着脂类加入会引起BARc蛋白的α螺旋含量的增加，也证实BARc结构域是和脂类的结合作用区域。BARc中包含有酸性氨基酸区域，因此Ca<2+>对BARc与脂类的相互作用的调节也进行了初步分析。CD结果表明，1mmol/LCa<2+>浓度可增加BARc的随机折叠但不会影响其α-螺旋，而当Ca<2+>和牛脑脂类提取物同时加入到BARc结构域的溶液中时，BARc的螺旋成分随之增加。可能说明Ca<2+>通过和BARc蛋白C端侧的酸性氨基酸的结合，导致BARc和脂类的结合能力增强。将PDZ结构域基因读框克隆到pE32M表达载体中，在E.coli BL21中表达目的蛋白主要是不溶性形式包涵体，经2mol/L脲素洗涤，和8mol/L 脲素溶解，变性蛋白经逐级降低脲素浓度透析复性，再经Ni—NTA agrose亲和层析柱，除掉杂蛋白后得到电泳纯的目的蛋白(His)<,6>-PDZ，经Bradford法测定蛋白质浓度，蛋白回收率约为复性前蛋白的60％。分别用此游离PDZ结构域与不溶性Amylose-MBP-BAR(128—360aa)混合，以Amylose亲和层析法对PICK1中BAR结构域和PDZ结构域进行相互作用研究。SDS-PAGE分析表明，两者确实存在蛋白一蛋白相互作用。为了定量地研究BAR-PDZ的相互作用，用ELISA法检测了游离的PDZ结构域与结合在Amylose亲和柱上的MBP-BAR的结合量，以摩尔计为16％±0.5％，由于诸多误差来源导致两种蛋白结合量偏低，但这一实验进一步证明PDZ结构域与BAR结构域之间确存在相互作用。此外，将PDZ结构域和BAR结构域分别克隆到pGADT7和pGBKT7质粒上，用酵母双杂交法也证明PDZ结构域和BAR结构域之间存在相互作用。为了研究PICK1及其结构域PDZ和BARc与AMPA受体亚基GluR2的C-末端区域之间的相互作用，以FTTC标记的多肽链GluR2的C末端多肽片段作为配体，进行荧光实验，测定了它们的结合常数。它们与GluR2C的结合比均为1：1，PICK1-GluR2C的结合常数为K<,(PICK1-GluR2C)>=1．0×10<7>M<-1>，PDZ-GluR2C的结合常数为K<,(PDZ-GluR2C)>=3．0×10<6>M<-1>。而GluR2C与BARc结构域间未观察到彼此存在明确的相互作用。本实验结果表明，PICK1蛋白与GluR2C之间存在相互作用主要位于PDZ结构域，而完整的PICK1结构域可能会增强它们间的相互作用。尽管实验证实PDZ结构域和BAR结构域之间存在相互作用，但本实验PICK1与GluR2C相互作用的检测表明PDZ和BAR两结构域间相互作用不影响PDZ结构域与GluR2C的相互作用，相比较而言，还能促进这种相互作用。