背景：Birt-Hogg-Dube’(BHD)综合征是一种罕见的常染色体显性遗传病,患者易发肾脏肿瘤、肺和肾的囊肿以及良性皮肤纤维性肿瘤。通过对BHD综合征患者家族基因型分析得到,BHD综合征的发病大多是由于Folliculin (FLCN)基因缺失或突变引起,该基因编码的FLCN蛋白结构或功能异常,而FLCN蛋白的功能目前尚不清楚。但在啮齿类动物模型中的研究认为该蛋白是一种肿瘤抑制因子。FLCN基因编码一种由579个氨基酸残基组成的70kD大小的古老的高度保守的蛋白,在真菌和哺乳动物中存在直系同源,在人体多个组织和器官中都可检测到其表达。文献报道,近年研究较多的Von Hippel-Lindau (VHL)综合征和结节性硬化症(tuberous sclerosis, TSC)中,患者易患良恶性肾脏肿瘤,对它们发病机制进行研究,发现此类疾病是由于细胞原纤毛(primary cilia)功能障碍,并且存在细胞转录翻译调控功能异常,进而导致组织囊肿或肿瘤形成。而BHD综合征患者临床上也表现为肾脏、肝脏和肺等多器官出现囊肿或良、恶性肿瘤,因此我们假设FLCN蛋白发挥功能可能和细胞原纤毛有一定关联,该蛋白结构和功能异常引发细胞原纤毛功能障碍,最终导致BHD综合征患者表现以上临床症状。因此猜测BHD综合征也是一种纤毛相关性疾病。纤毛是一种从低等到高等生物都比较保守的、由细胞表面向外伸出的细长突起结构,分为纤毛膜、轴丝(axoneme)和基体(basal body)三部分。纤毛膜是细胞膜的延伸,包被在纤毛外面、高度分化的膜结构,膜上有许多纤毛相关信号通路的受体；内部是微管组成的轴丝,由9组二联体微管(mirotubule doublets)及附属蛋白规律环形排列一圈,根据环形微管内部有无中心微管,分为运动型和非运动型纤毛；基体是细胞中心体的同源结构,细胞处于分裂期时,中心体和纺锤丝组成纺锤体,细胞由分裂期进入静止期,中心体不再形成纺锤体而转变为基体,作为纤毛形成的结构基础。由基体顶端聚合微管蛋白形成原纤毛轴丝,基体也是许多纤毛相关蛋白聚集的部位,许多纤毛相关的信号都要通过基体传递到细胞其他部分。原纤毛属于非运动型纤毛,轴丝内不含中心微管,故不能运动,但它可以作为细胞的感觉器官,通过原纤毛膜上聚集的众多信号通道受体,感知细胞外光学、温度、渗透压、机械力、声音和激素水平等刺激,将快速捕捉到的各种外界信号转导入细胞内部,并对此迅速产生反应,以适应细胞生存。原纤毛的功能障碍是纤毛相关疾病发病的主要原因,它主要由于纤毛形成或功能维持的相关蛋白发生基因突变,导致纤毛的形态和／或数量改变,功能异常。这类疾病临床上主要表现为多囊肾、失明、智力迟滞以及糖尿病、肥胖等。纤毛功能障碍被越来越多的认为和几种癌症类型的发生相关,包括肾癌、黑色素瘤、胰腺导管腺癌和卵巢癌等。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR),是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,属于磷酸肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3-K)相关激酶家族成员,在感受细胞外营养信号、调节细胞生长与增值过程中起关键作用。mTOR信号通路在细胞生长中处于核心地位,整合胞外多种信号,可在多种因素的活化下参与基因转录、蛋白翻译起始、核糖体合成和细胞凋亡等多种生物学过程。正常情况下mTOR信号通路有一定生物活性以维持正常机体生理代谢,然而,mTOR信号通路异常与肿瘤发生密切相关。该通路在肿瘤发生过程中过度活化,环境因素也会引起细胞代谢失调,致使细胞异常增殖、分化、生长和存活,从而导致肿瘤形成。通过研究弄清楚该通路异常的机制可能为肿瘤治疗提供新的靶点。有文献报道,在BHD综合征患者体内取下的肿瘤组织中,检测到mTOR信号通路的异常激活。而mTOR通路和BHD综合征肿瘤发生的具体机制仍有待于研究。目的：本研究以人近端肾小管上皮细胞HKC8细胞为主要靶点,试图证明FLCN蛋白在BHD综合征肾脏肿瘤发生过程中起到重要作用。从受体和信号转导通路的角度,研究该蛋白在细胞原纤毛中的功能,并引入细胞外流体剪应力刺激,探讨原纤毛在正常肾脏形态和功能维持中的必要性。明确FLCN蛋白通过磷酸化AMPK抑制mTOR信号通路活性的具体机制,及与细胞原纤毛的联系,以预防肾脏肿瘤发生,维持正常肾脏组织形态。为进一步阐明BHD综合征发病机制提供实验依据,并为其治疗提供新的思路和方法。方法：本课题以人肾小管上皮细胞系HKC8细胞和BHD综合征患者体内分离的肾癌细胞UOK257、UOK257-2细胞为研究对象,应用细胞培养、免疫印记、shRNA干扰、免疫共沉淀和细胞免疫荧光等方法,并引入细胞流体剪应力培养系统,通过比较细胞在静止培养液条件下和流体培养液产生胞外剪应力刺激条件下FLCN蛋白对mTOR信号通路的影响,试图揭示流体剪应力刺激对细胞的作用。将所设计的shRNA连接在pLKO-Tet-On质粒上,构建诱导性表达质粒。通过过表达HA-和GFP-标签的FLCN融合蛋白或利用shRNA干扰FLCN基因表达等改变FLCN蛋白水平,将细胞分别培养在静止培养液和流动培养液条件下,Western Blot检测细胞mTOR通路下游蛋白S6和4E-BP1磷酸化水平的改变；同时关注mTOR上游AMPK、AKT何种蛋白在该信号通路的调控中发挥作用；随后还研究了该通路的激活是否需要上游相关激活蛋白参与；最后为研究原纤毛在整个信号转导过程中的作用,诱导性敲低原纤毛生成的重要蛋白IFT88后,检测mTOR相关上、下游蛋白的磷酸化改变,验证原纤毛是否在mTOR信号通路调控过程中发挥作用；除此之外,形态学上,还通过免疫荧光方法观察不同生长条件下细胞原纤毛形成及不同刺激条件下细胞内相关蛋白转移定位现象。最后检测原纤毛下游、与肿瘤相关的WNT信号通路的效应蛋白,探讨FLCN蛋白与肿瘤发生的关系。Western Blot结果图用Image J进行灰度分析测量,对数值利用SPSS 13.0进行统计学检测。结果：1. FLCN蛋白作为一种纤毛相关蛋白在细胞内发挥作用(1)在HKC8细胞中,细胞生长密度达到一定高水平,会出现接触抑制现象,细胞即从分裂期进入静止期。维持细胞该种状态继续培养72 h,通过免疫荧光实验,对原纤毛内的微管蛋白进行染色,即可看到细胞出现单一短毛结构,即为被染色的细胞原纤毛。每个细胞仅有一根原纤毛存在。(2)在有原纤毛形成的静止期细胞中,免疫共沉淀实验发现FLCN蛋白可以和原纤毛内重要转运蛋白KIF-3A有相互作用；进一步比较处于分裂期和静止期的细胞,是否都存在FLCN和KIF-3A的相互作用,经过实验验证得知处于分裂期、未形成原纤毛的细胞中不存在FLCN和KIF-3A两种蛋白的相互作用,这种相互作用必须建立在原纤毛形成的基础之上。提示FLCN是一种纤毛相关蛋白。2.过表达FLCN蛋白不影响细胞mTOR信号通路活性构建HA和GFP标记的FLCN融合蛋白,将质粒转染入HKC8细胞后,检测到FLCN外源融合蛋白量是正常细胞组内源FLCN蛋白表达量的10倍；比较细胞在普通静止培养基培养条件和接受细胞外流体剪应力刺激条件下,对mTOR信号通路的影响。利用Western Blot检测mTORCl上游蛋白AKT、AMPK和下游蛋白S6、4E-BP1激活情况,结果显示不同条件下各蛋白磷酸化水平和总蛋白量均无显著改变。说明细胞内FLCN蛋白过量表达对mTOR信号通路无显著影响。3. FLCN蛋白敲低或缺失在流体剪应力刺激(FLOW)条件下会减弱对mTOR信号通路的抑制作用(1)将FLCN-shRNA连接在pLKO-Tet-On质粒上,转染入HKC8细胞,分别给于0、0.1、0.5和1.0μg/ml诱导药物多西环素(Doxycycline, Doxy)处理细胞,结果显示给于药物后shRNA干扰组显著抑制了FLCN蛋白表达,总蛋白量比对照组下降约80%。FLCN蛋白降低对mTORC1下游S6、4E-BP1蛋白磷酸化无影响,单纯给于诱导药物亦不会影响细胞mTOR信号通路的活性。(2)细胞在静止培养基培养条件下,选择两株稳定表达FLCN诱导性敲低质粒的细胞,发现对mTOR信号通路中mTORC1上游AKT、AMPK,下游S6、4E-BP1蛋白均无显著影响。然而细胞在胞外流体剪应力刺激条件下,正常细胞表现为AKT蛋白T308和S473磷酸化水平降低,AMPK蛋白磷酸化水平显著升高,下游S6和4E-BP1蛋白磷酸化降低,mTOR信号通路活性被抑制；FLCN蛋白诱导性敲低组S6和4E-BP1蛋白磷酸化水平只有轻微下降,上游AKT磷酸化降低水平与正常细胞组相同,AMPK蛋白磷酸化则只有轻度升高,导致mTOR信号通路活性仍处于较高水平。在FLOW条件下FLCN正常和敲低组,对AMPK和S6磷酸化和总蛋白条带进行灰度分析,结果运用SPSS 13.0进行统计分析,结果显示存在显著性差异(AMPK磷酸化水平实验中F=28.274,P=0.001；S6磷酸化水平实验中F=16.449,P<0.001)。在BHD综合征患者体内分离的FLCN缺失肾癌细胞UOK257细胞中同样观察到FLOW条件下mTOR信号通路处于异常激活状态,重新再表达FLCN的UOK257-2细胞则表现为该通路活性受抑制。对FLOW条件下两组UOK细胞之间AMPK和S6磷酸化和总蛋白条带进行灰度分析,结果运用SPSS 13.0进行统计分析,结果显示存在显著性差异(AMPK磷酸化水平实验中F=8.944,P=0.007；S6磷酸化水平实验中F=19.636,P=0.002)。以上结果提示,FLCN对mTOR信号通路活性起到抑制作用,是通过接受FLOW条件下流体剪应力刺激,作用于mTORC1上游抑制蛋白AMPK,而后引起下游效应蛋白S6、4E-BP1活性降低。4.LKB1参与FLCN蛋白对mTOR的调控过程(1)HKC8细胞在有或者无FLOW刺激下,应用免疫共沉淀实验,验证FLCN和AMPK蛋白存在相互作用。并且还发现,在FLOW存在的条件下,和FLCN结合的AMPK磷酸化水平显著高于无FLOW组,这提示AMPK在和FLCN结合后更容易被磷酸化激活。(2)为明确FLCN对AMPK的调控机制是否需要AMPK上游激酶LKB1蛋白的参与,给于FLCN正常或敲低组细胞AMPK激活剂2DG,20mM处理2 h。结果显示两组细胞在接受2DG刺激后AMPK都显著激活,下游S6和4E-BP1蛋白磷酸化降低,这一过程和FLCN蛋白水平无关。(3)设计LKB1-shRNA,构建诱导性敲低质粒,转染入HKC8细胞,通过Western Blot检测该蛋白量降低约70%。稳定细胞株FLOW条件下实验发现LKB1蛋白敲低后会降低AMPK磷酸化水平,mTORC1下游效应蛋白活性相应升高,该实验证明前面观察到的FLCN抑制mTORC1活性效应是由于LKB1激活AMPK蛋白引起。5. FLCN募集LKB1蛋白使AMPK在原纤毛基体部位激活在HKC8细胞中,免疫共沉淀实验证明LKB1-AMPK-FLCN在FLOW条件下存在相互作用；而没有FLOW刺激的情况下LKB1不能够特异性的拉下AMPK和FLCN蛋白,即三种蛋白没有相互作用存在。证明LKB1、AMPK和FLCN三种蛋白可以形成作用AMPK蛋白会形成颗粒状团块,并且特异性的聚集在原纤毛底部。用y-tubulin对原纤毛基体进行染色可以看到磷酸化AMPK和基体有共定位现象,证实磷酸化的AMPK定位于原纤毛基体部,FLCN将AMPK特异性募集至基体,并在此被其激酶LKB 1磷酸化激活,发挥对mTOR信号转导通路的抑制作用。6.原纤毛是正常细胞FLOW条件抑制mTOR通路的必要器官(1)IFT88蛋白作为原纤毛形成和延伸的重要蛋白,为研究细胞原纤毛在mTOR通路调控中的作用,设计IFT88-shRNA,构建诱导性敲低质粒,转染入HKC8细胞,通过Western Blot检测蛋白表达水平降低约60%,影响原纤毛生成,免疫荧光染色显示细胞原纤毛数量显著下降。免疫共沉淀实验显示,原纤毛生成障碍导致FLCN和KIF-3A蛋白相互作用减弱甚至消失,进一步证明FLCN是一种纤毛相关蛋白。(2)在IFT88敲低、原纤毛生成受抑制的细胞中,比较原纤毛缺失对细胞感知FLOW条件下流体剪应力刺激的反应,Western Blot检测发现正常细胞的原纤毛可以感知胞外剪应力刺激而抑制mTOR信号通路活性,IFT88敲低组表现为mTOR活性未被抑制呈现异常增高,AMPK磷酸化程度也低于正常细胞组。该结果表明正常细胞对mTOR信号通路的抑制作用是通过细胞原纤毛发挥功能的。(3)另外,我们还在IFT88蛋白敲低组发现,在纤毛生成障碍后,LKB1-AMPK-FLCN相互作用减弱甚至消失。同样也解释了原纤毛生成障碍的细胞中AMPK磷酸化水平比正常细胞组偏低。综合以上结果得知,只有在细胞原纤毛存在且功能完整的情况下,细胞才能感知外界剪应力信号,抑制mTOR信号通路活性。7. FLCN蛋白会调控细胞FLOW条件WNT信号通路在FLCN诱导性敲低的HKC8细胞和UOK257、257-2细胞中,检测和原纤毛相关的WNT信号通路。结果显示,在FLOW条件下,FLCN蛋白敲低使得CD44和Cyclin D1蛋白表达水平上调。其中CD44蛋白参与参与细胞增殖、分化与肿瘤的侵袭、迁移过程；Cyclin D1蛋白过度表达会导致细胞生长失控而易于癌变。这说明FLCN蛋白缺失或功能异常与肿瘤发生密切相关。结论：1. FLCN蛋白是一种纤毛相关蛋白在细胞内发挥功能。2.过表达FLCN蛋白不影响细胞mTOR信号通路活性,但敲低FLCN蛋白后,细胞在流体剪应力刺激的FLOW条件下会减弱对mTOR信号通路的抑制作用。3.细胞原纤毛和基体部的FLCN对于原纤毛功能,及其下游的信号转导通路起重要作用。FLCN对mTOR信号通路的抑制作用是通过募集LKB1和AMPK蛋白,在原纤毛基体部位将AMPK磷酸化而实现的。4.细胞原纤毛作为一种重要的剪应力感受器,在有FLOW存在的条件下感知胞外信号刺激,对细胞内多种信号转导通路进行调控。5. FLOW条件下缺失FLCN蛋白会上调肿瘤相关Wnt信号通路中CD44和Cyclin D1蛋白水平,导致细胞生长分裂异常活跃,致使肿瘤形成。