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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见于中老年的神经系统疾病,是继老年性痴呆(Alzheimer’s disease,AD)之后的第二号神经疾病杀手,多在60岁以后发病,主要表现为患者动作缓慢,手脚或身体的其它部分的震颤,身体失去柔软性,变的僵硬,所以又称“震颤麻痹”,主要是因位于中脑部位“黑质”中的细胞发生病变后,多巴胺的合成减少,抑制乙酰胆碱的功能降低,从而导致乙酰胆碱的兴奋作用相对增强。两者失衡的结果便出现了“震颤麻痹”。迄今为止,PD的病因仍不清楚,目前的研究倾向于与年龄老化,遗传易感性和环境毒素的接触等综合因素有关。PD典型的病理改变包括α-synuclein和胞浆内含物路易氏(Lewy body)的出现。随着蛋白质组学以及相关技术的快速发展,质谱技术已经广泛的应用于疾病发病机理的研究。蛋白质糖基化是重要的翻译后修饰方式之一,对细胞的正常生长起着重要的作用,能够直接或间接的影响蛋白质的生物学功能。异常的蛋白质糖基化在PD的发生发展中起着重要的作用,课题组前期通过糖蛋白组学技术,从正常人、不同发病程度的PD患者的脑脊液和脑组织中富集糖蛋白,用iTRAQ试剂对胰酶酶解后的糖肽进行定量标记,利用反相色谱和MALDI-TOF/TOF质谱技术鉴定并获得了在脑组织和脑脊液中表达的糖蛋白谱,并对差异表达的糖蛋白进行了定量分析。总结定量糖蛋白组学发现,钠离子通道β4亚基在PD不同阶段病人脑组织中表达明显升高,本文在前期研究的基础上对钠离子通道β4亚基在PD转基因鼠脑组织中的表达变化进行了验证,并对钠离子通道β4亚基蛋白糖链的生物学功能进行了初步研究。1.钠离子通道β4亚基蛋白在PD转基因鼠脑组织中的表达:抽提PD基因鼠和野生鼠脑组织中总RNA,经过反转录成cDNA,通过RT-PCR反应验证在mRNA水平的表达变化;抽提脑组织膜蛋白,用特异性的抗体经western-blot反应验证在蛋白水平的表达变化。2.钠离子通道β4亚基蛋白的糖链生物学功能:钠离子通道β4亚基蛋白是高度糖基化的蛋白,为了研究糖链的功能,选择不同生长发育阶段的野生鼠脑组织膜蛋白,经PNGase F酶处理,特异性的去除N-连接的寡糖链,观察蛋白的表达变化;同时对β4亚基的全序列进行克隆表达,并将其细胞外的4个潜在的糖基化位点进行突变,构建去糖基化的β4-MUT表达质粒,将β4-WT和β4-MUT分别转染小鼠脑胶质瘤细胞Neuro2A,同时以空质粒组作为对照,用5mM dbcAMP促分化24h后,用抗-β4抗体对细胞进行免疫组化染色,激光共聚焦显微镜下记数不同实验组细胞的轴索长度和丝足样纤维结构数量的多少。实验结果显示,钠离子通道β4亚基蛋白在PD转基因鼠脑组织中表达明显升高,同时受生长发育的调控,在出生后7天才有β4蛋白的表达。用能够特异性的切除N-连接寡糖链的内切酶PNGase F处理膜蛋白后,弥散表达的高分子量β4亚基蛋白变成迁移速度较快的低分子量蛋白。轴索向外生长能力实验显示,去糖基化突变质粒β4-MUT能够促进轴索的生长和纤维样结构的数量,与表达β4-WT质粒的细胞和空质粒对照相比,具有明显的差异(**P<0.01)。结论:钠离子通道β4亚基蛋白在PD基因鼠中表达上调,受生长发育的调控,在出生后7天开始表达;钠离子通道β4亚基作为细胞粘附分子在中枢神经系统中起着重要的作用,其N-连接的糖链可能参与了疾病的发生。