妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是指妊娠期首次发生或发现的任何程度的糖耐量受损,包含了部分妊娠前已患有糖尿病但孕期首次被诊断的患者。GDM临床经过复杂,容易造成多种不良结局,对母婴有严重的危害甚至有长远的影响。目前关于GDM的发病机制尚不明确,已有的研究表明,GDM的病因是多源性的,可能是遗传因素和环境因素共同作用的结果。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度为18-23个核苷酸的,进化过程中高度保守的,在表观遗传学水平发挥负调控作用的单链小分子非编码RNA。近年来的研究发现越来越多的miRNAs在GDM发病过程中起了重要作用。胎盘是唯一连接母胎的界面,是母胎物质交换的场所,因此成为研究GDM这类糖代谢异常疾病发病机制的重要器官。为了探索在GDM中,miRNAs的分子生物学调控机制,前期我们利用miRNAs芯片筛选了在GDM和正常胎盘中差异表达的miRNAs。在本研究中我们利用qRT-PCR和原位杂交在GDM和正常人群样本中进行验证。对于差异表达的miRNAs,采用生物信息学预测其靶基因,并通过构建靶基因的3’非翻译区表达质粒在双荧光素酶报告系统中验证候选miRNAs对其靶基因表达的调控。利用候选miRNAs及其靶基因的过表达、敲低及恢复实验,研究候选miRNA通过靶基因对胎盘来源的人绒毛膜滋养层细胞细胞增殖、活性、凋亡、迁移和侵袭等功能的影响。根据miRNAs芯片结果,我们选择了 let-7b、miR-1202和miR-29b 3个差异表达的miRNAs利用qRT-PCR在大规模的人群中进行验证,结果显示miR-29b在GDM中的表达水平显著低于正常对照,年轻正常产妇的表达水平显著高于年龄较大的产妇。原位杂交结果显示miR-29b定位于胎盘滋养层细胞。MiR-29b过表达可以抑制细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡;MiR-29b敲低可以促进细胞迁移和侵袭。为了研究miR-29b发挥作用的分子机制,我们通过miRBase和TargetScan预测了 miR-29b的靶基因,筛选出了 3个与糖尿病和GDM相关的候选miR-29b靶基因:ING2、ING3和HIF3A。双荧光素酶报告系统分析显示miR-29b模拟物与HIF3A 3’-UTR共转染细胞,可以降低荧光素酶活性;MiR-29b抑制剂与HIF 3’-UTR共转染细胞可以升高荧光素酶活性;而miR-29b模拟物或抑制剂与ING2或INNG3 3’-UTR共转染细胞,对荧光素酶活性没有显著影响。这些结果提示了HIF3 可能是miR-29b的靶基因。为了进一步验证二者的关系,我们将HIF3’-UTR上miR-29b的识别、结合位点突变,发现其突变后与miR-29b的结合能力显著降低。同时,我们利用Western blot分析了 miR-29b对内源性靶基因表达的影响,结果显示miR-29b可以反向调节HIF3A的表达,这些结果证实了HIF3 是miR-29b的靶基因。HIF3A过表达可以促进细胞增殖、迁移和侵袭抑制细胞凋亡;HIF3A敲低可以抑制细胞迁移和侵袭。为了研究HIF3A是否为miR-29b功能性的靶基因,我们利用基因补偿实验分析了 miR-29b和其靶基因对细胞生物学行为的影响。当滋养层细胞HTR8-/SVneo过表达miR-29b,补充外源性的HIF3A可以拮抗miR-29b过表达引起的细胞增殖、迁移和侵袭抑制;当HTR8-/SVneo低表达miR-29b,抑制内源性HIF3A表达可以使细胞迁移和侵袭基本恢复正常水平。本研究的结果显示在GDM胎盘中miR-29b表达水平降低,其通过上调HIF3A的表达,促进胎盘滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究从分子流行病学的角度研究了 miR-29b与GDM的相关性。同时,也确定了 miR-29b对胎盘来源的滋养层细胞功能的影响。