癫痫(Epilepsy)作为一种常见的神经系统疾病，严重威胁着人类健康。癫痫是一种由大脑神经元异常放电所引起的以短暂的脑功能失常为特征的慢性脑部疾病。其发病机制复杂多样，至今仍未阐明。近年研究认为癫痫综合征是一种“离子通道病”，钙调蛋白对电压门控性钠通道(voltage-gated sodium channel，VGSC)的功能具有重要的调节作用。因此，电压门控性钠通道在神经元动作电位的产生与传播过程中发挥着重要作用，由一个α型大亚基和多个β型小亚基组成。研究表明，钠通道的门控动力学的异常功能在不同的癫痫表型中被证实，如伴热惊厥性全身性癫痫(Generalized epilepsy with febrile seizure plus，GEFS+)、幼年严重肌痉挛癫痫发作（Severe myoclonic epilepsy of infancy，SEMI）、伴有全身性强直阵挛发作的儿童期难治性癫痫(Intractable childhood epilepsy withgeneralized tonic-clonic seizures，ICEGTC)等。中枢神经系统主要表达Nav1.1，Nav1.2，Nav1.3，Nav1.6四种亚型。　　 CaM是一种广泛存在于真核细胞的钙离子结合蛋白，由148个氨基酸(17KD)组成，外形似哑铃，具有两个序列结构同源性的结构域(N-结构域与C-结构域)，每个结构域均有两个钙离子的结合位点。钙离子通过与其结合而改变CaM构象，进一步影响CaM与CaM结合蛋白(Calmodulin-binding proteins，CaMBPs)结合，进而参与众多疾病的发生与发展。因此，本实验拟通过分子生物学、细胞培养和膜片钳等手段，明确钙调蛋白(CaM)对电压门控性钠通道的调节作用，将为阐明癫痫发病机制提供了新思路。　　 方法：　　 一、海马原代神经元培养与无镁癫痫细胞模型的构建　　 采用原代细胞培养技术，取新生24小时内的大鼠，麻醉后，取海马组织，在含有0.25％的胰蛋白酶的Hanks平衡盐溶液处理后，用含有15％胎牛血清和抗生素的DMEM培养液培养。24小时后，将培养基更换为NeurobasalTM，每3-4天更换培养液。12天后得到原代培养细胞。用不含镁的培养液处理细胞3小时后，采用电压钳技术检测细胞的自发性动作电位。　　 二、钠通道活性的检测　　 应用膜片钳技术细胞贴附式和内膜向外记录细胞膜电压门控钠通道的电流。刺激去极化从-100mV至-60mV，钳制电压为-100mV，刺激持续时间为200ms。持续选择后面100ms作为持续钠电流进行结果分析。用pClamp10软件记录数据并以pClamp10分析软件进行分析，主要观察指标为平均电流和通道开放概率。　　 三、免疫印迹检测钠通道各亚型及钙调蛋白的表达　　 分别提取正常组与无镁组总蛋白。考马斯亮蓝法测蛋白浓度，进行SDS-PAGE蛋白电泳，一抗(anti-Nav1.1，1∶200稀释;anti-Nav1.2，1∶200稀释;anti-Nav1.3，1∶200稀释;anti-Nav1.6，1∶200稀释)孵育，ECL显影。　　 四、钙调蛋白及其突变体的表达与纯化　　 突变体点突变(CaM1234)参照QuickchangeTM点突变试剂盒说明书完成。目的片段CaM连入pGEX载体，转化到大肠杆菌BL21中，以glutathione-S-transferase(GST)融合蛋白形式表达;IPTG（终浓度1mM）诱导，加入溶菌酶后超声和液氮反复冻融破碎菌体，加入适量GST-beads，反复洗beads后用PreScission Protease5μl切割，释放靶蛋白;SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度;Bradford法检测蛋白浓度，最后将蛋白置于-20℃保存。　　 五、CaM对电压门控钠通道调节作用的观察。　　 在细胞粘附模式下记录记录电压门控性钠通道的电流，先形成膜内向外的模式，再将膜片移入含有3mM ATP和CaM及其突变体的小灌流槽中，观察电压门空性钠通道的电流变化，分析通道开放概率变化，　　 六、结果分析　　 采用SPSS13.0软件，Students t检验进行结果分析，分子生物学应用均数±标准差，膜片钳应用均数±标准误。P＜0.05表示组间差异具有统计学意义。　　 实验结果：　　 1.采用原代细胞培养技术，12天后成熟的原代培养细胞，形成网状结构。用无镁培养液处理3小时后，进行膜片钳实验，可见频率为8到20 Hz，持续时间为10 sto3 min的癫痫波，这种癫痫波的出现表明无镁癫痫细胞模型建立成功。　　 2.应用膜片钳在细胞粘附式下检测到钠通道活性。去极化为从-100mV至-60mV，钳制电压为-100mV，持续时间为200ms。与正常组相比，经无镁处理3h后细胞膜钠通道持续钠电流的开放频率升高。　　 3.应用Westen Blot免疫印迹方法检测无镁癫痫细胞模型中钠通道各亚型的表达，结果表明钠通道Nav1.1，Nav1.2，Nav1.3表达增加;而在无镁癫痫细胞模型中CaM表达不变。　　 4.与正常组相比，CaM对无镁组癫痫模型钠通道持续钠电流的开放频率。　　 5.与野生型CaM不同，CaM1234不能增加无镁组癫痫模型钠通道持续钠电流的开放频率。　　 结论：　　 1.无镁癫痫细胞模型的钠通道活性升高。　　 2.Nav1.1，Nav1.2，Nav1.3在无镁细胞模型中表达上调，CaM表达不变。　　 3.CaM对无镁组癫痫模型钠通道活性调节更显著。　　 4.与野生型CaM不同，CaM1234对无镁组癫痫模型钠通道活性调节不明显，证明功能性的N环和C环对无镁组癫痫模型钠通道活性调节是必要的。