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1研究目的构建角蛋白19(K19)启动子驱动表达的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因(HSV-TK)载体系统,探讨其在肿瘤的基因治疗中的意义。2材料与方法pK15-Tk来自宾夕凡尼亚大学医学院George Cotsarelis教授的馈赠。PAM212是一种恶性转化的小鼠角质形成细胞系,由美国国立卫生研究院Stuart Yuspa教授馈赠,第二军医大学李晋处获得。基因组DNA抽提试剂盒及Pfu Taq酶购自申能博彩,PrimeSTAR? HS DNA多聚酶购自大连宝生物。PCR产物胶回收试剂盒购自E.Z.N.A公司。DMEM培养基(Hyclone),胎牛血清(美国GIBCO公司),转染试剂Lipofectamine 2000和Opti-MEM均购自美国Invitrogen公司。2.1 K19启动子的扩增和载体的构建用基因组DNA抽提试剂盒从出生4天内Balb/c小鼠的皮肤组织中抽提基因组DNA,处死新生鼠后,将其在70%酒精中飘洗两遍,在无菌环境下剥除部分皮肤,接下来的具体方法参照说明书。PCR方法从Balb/c小鼠的基因组DNA中扩增出K19启动子区域。PCR中使用了两套引物来扩增两种不同大小的K19启动子片段。扩增完整序列(-2.1Kb)的引物是C G G C T C G A G A A G T T C C T T T C T A A G A C C C A (K19F1)和AGGACTAGTGGAAAAAGGGACGCAGGTCT (K19R);扩增部分序列(-0.5Kb)的引物是A G G C T C G A G T T AT C A C A A G G A G G G A G G G A (K19F1)和AGGACTAGTGGAAAAAGGGACGCAGGTCT (K19R)。分别在两对引物5’端引入Xho 1和Spe I的酶切位点。使用Pfu Taq酶从0.2ug基因组中扩增K19(-0.5Kb)反应条件:初始变性在95°C 4分钟后,30个循环分别为95°C变性、退火57°C、延伸72°C均为60秒,最后延伸为72°C8分钟。用PrimeSTAR? HS DNA多聚酶从0.5ug基因组DNA中扩增K19(-2.1Kb)反应条件:初始变性在95°C 4分钟后,30个循环分别为98°C变性、退火54°C、延伸72°C分别为10S、15S和两分钟,最后延伸为72°C10分钟。所得PCR产物经琼脂糖电泳分离,用胶回收试剂盒纯化,Xho 1和Spe I限制内切酶酶切5小时后再次琼脂糖电泳分离、胶回收试剂盒纯化。所得DNA片段与pK15-tk酶切后的片段用连接试剂盒16°C连接1小时,GaCl2法转化DH5a感受态细胞。构建质粒经酶切、琼脂糖电泳鉴定后将符合的克隆送测序。2.2细胞培养和瞬时转染Pam212细胞系和人肺癌细胞系A549以及人宫颈癌细胞系Siha和Hela在DMEM培养基(添加10%胎牛血清)中培养。每三到四天换液,接近融合时消化成单细胞悬液接种在6孔板中。细胞转染依照说明书进行,简言之,细胞接种在6孔板后,一般经过夜培养后达到90%融合且生长在对数期,脂质体和质粒DNA以6μl:4μg的比例分别在250ul Opti-MEM中稀释,将二者混匀后加入培养液中。在培养箱中经过48小时的培养后,换液并加入GCV(浓度为100μM)。2.3 MTT细胞活力测定首先,0.2μg质粒DNA和0.5μl的脂质体分别在25μl的Opti-MEM中稀释,混匀后的复合物加入96孔板中,20分钟后100ul的单细胞悬液被直接接种到孔板中,在培养箱中经过48小时的培养后,GCV依照不同浓度加入培养液中(0,2μM ,10μM ,100μM)。72小时过后,MTT法测定细胞活力。2.4流式细胞学检测转染后的细胞在含有100μMGCV的培养液中孵育72小时后,弃去培养液,用PBS洗一遍,消化成单细胞悬液,1500RPM离心5分钟,再次用PBS洗,在预冷的70%乙醇中放置过夜,离心去除乙醇,用含PI(propidium iodide)的DNA染色剂避光染色半小时后,流式细胞仪检测。3结果3.1 GCV诱导转染后的PAM212、A549细胞死亡呈剂量依赖性MTT结果表明,转染细胞以PAM212为例,加入GCV72小时后,用不加GCV组结果调零后,2μM浓度组有19.4%的细胞死亡,10mM和100mM分别为44.4%和58.7%。A549的结果与之较为相似,但是出乎我们意料的是,两种人宫颈癌细胞系Hela、Siha在转染后并没表现出对GCV的敏感性,细胞活力各组之间没有明显的差别。3.2细胞周期分析GCV对转染后Pam212和A549细胞周期产生了明显影响,S期细胞比例相对于未转染细胞明显增高,同时亚G1峰所代表的调亡率也明显高于对照。两种不同大小的K19启动子片段在我们的试验中显示出相同的作用。