产喹诺里西啶生物碱苦豆子内生真菌的筛选与产碱条件的优化

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苦豆子(Sophora alopecuroides L.)为豆科槐属多年生草本植物,主要分布于我国西北荒漠、半荒漠地区,是天然草场的先锋植物,也是宁夏重要的道地药材。其重要活性成分生物碱为喹诺里西啶类生物碱,具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫和增强免疫等多种功效。生产上获得苦豆子活性成分的方式主要依靠大量刈割苦豆子从植物中提取。苦豆子野生资源有限,不合理的利用导致野生草场沙化。人工培育成本高,且植株药效难以满足需求。植物中普遍存在内生真菌,许多研究表明,内生真菌可以产生与宿主植物相同或相近的活性成分。基于此,本研究在建立苦豆子喹诺里西啶生物碱检测体系的基础上,以分离纯化的苦豆子内生真菌为材料,筛选产喹诺里西啶生物碱的内生真菌菌株,并进行鉴定;利用响应面分析不同因素对苦豆子内生真菌合成生物碱的影响,优化产碱条件;运用紫外诱变及亚硝基胍化学诱变的方法,诱变选育高产生物碱的突变菌株,为苦豆子内生真菌产生物碱机制研究和野生苦豆子内生真菌资源的开发利用提供理论依据。研究结果如下:1.确定了在超声时间60min下,以甲醇作为提取溶剂,加入纤维素酶为最佳提取苦豆子喹诺里西啶生物碱的方法。建立了苦豆子喹诺里西啶生物碱提取及检测方法薄层层析(TLC)采用以乙酸乙酯:乙醇:浓氨水(5:1:0.5)为最佳展开剂,显色剂为改良碘化铋钾,样品点样量为5μL进行定性检测。高效液相色谱(HPLC)条件为流动相:0.01mol磷酸缓冲液-甲醇(55:45),紫外检测波长216nm,流速为1.0mL·min-1,对样品进行定性定量检测。2.采用生物碱沉淀法、TLC和HPLC方法,从20株苦豆子内生真菌中,筛选获得1株产槐定碱的苦豆子内生真菌菌株DSD201,经过形态和分子鉴定,该菌株为细极链格孢A lternaria alternata。3.对苦豆子产碱内生真菌DSD201的产碱条件进行优化,结果表明:DSD201菌株在PDB培养基上培养5d时菌丝生长最好,菌丝干重0.971g,响应面分析得出培养基中添加前体物质L-哌啶酸浓度为10×1 0-3.85mol·L-1、L-赖氨酸浓度为10× 10-2.03mol·L-1和α-酮戊二酸浓度为10× 10-4.31mol·L-1时,DSD201菌株产槐定碱产量达到最大。4.以DSD201菌株为材料,通过紫外辐照诱变和化学诱变的方法,筛选出1株产碱量显著增加的菌株D2,与野生型菌株相比产碱量增加了 35.59%。筛选出1株产碱量显著降低的菌株E2,与野生型菌株相比产碱量降低了 47.88%。
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