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目的T细胞受体(T cell receptor,TCR)对肿瘤抗原的识别为T淋巴细胞活化提供初始刺激。TCRβ的V区有24个亚家族,在正常情况下,机体未受任何抗原刺激,正常人T细胞的TCRβ重排应是随机的,即呈多家族性,各家族的T细胞均执行各自的职能。有研究利用RT-PCR检测TCR Vβ24个亚家族的基因片段而了解正常人和肝癌病人的TCRVβT细胞的表达特点。结果显示健康人PBMC中T细胞受体基因的表达呈随机分布,而肝癌病人的T细胞对于肿瘤细胞的刺激却表现出偏好性。我们以往的研究显示,肝癌患者TCR Vβ7亚家族对于肿瘤细胞的刺激表现出偏好性的扩增,因此我们推测TCRV Vβ7可能与肝癌患者的肿瘤免疫反应有关。我们在之前的研究中发现,TCRVβ7.1基因修饰的T细胞能有效诱导肝癌细胞凋亡,在此基础上本研究构建了人TCRVβ7.1真核表达质粒,转入人T淋巴细胞中表达,进一步研究经TCR基因修饰的T细胞信号通路的激活情况,为今后研究转TCR基因治疗肿瘤以及研究肿瘤患者T细胞免疫耐受的机制奠定了基础。方法概括起来说本研究由三部分组成:第一部分为人TCRVβ7.1真核表达质粒的构建;第二部分为研究重组质粒pcDNA3.1(+)/TCRVβ7.1转染T细胞的效率,用流式细胞仪检测TCRVβ7.1表达量;第三部分用ELISA法检测IL-4、INF-γ的表达量,用Western Blot方法检测Erk1/2、Zap-70这两种蛋白总量及磷酸化水平的改变。结果(1)扩增出TCRVβ7.1基因,将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+),所构建的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/TCRVβ7.1经酶切、PCR鉴定显示插入片段大小正确;DNA测序结果显示所构建的重组表达载体序列正确。(2)重组质粒pcDNA3.1(+)/TCRVβ7.1转染人T淋巴细胞后,流式细胞仪检测TCRVβ7.1表达结果显示,转染后的两组细胞TCRVβ7.1表达率明显高于未转染组,说明脂质体介导的基因转染方法可以有效地将TCRVβ7.1基因转入健康人PBMC并得到有效表达。(3)Western Blot结果显示,转染TCRVβ7.1基因的PBMC组中ERK1/2,p-ERK蛋白表达水平明显高于未转染组(P<0.01)。p-ERK1/2蛋白表达与T激活有关,而p-Zap-70只有在抗原刺激早期有表达。ELISA结果表明,转染组INF-γ水平明显高于未转染组,而IL-4无明显改变。结论(1)成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/TCRVβ7.1,并在转染的PBMC中得到有效表达。(2)首次对转染TCRVβ7.1基因的T淋巴细胞的ERK1/2、Zap-70蛋白表达量和磷酸化水平进行了系统的研究,并对其与细胞因子分泌水平之间的关系作了初步探讨。