目的肝胆恶性肿瘤包括肝脏肿瘤以及胆道系统肿瘤,其恶性程度高,手术难度大,预后很差,手术根治性切除仍然是目前最有效的方法,但是术后居高不下的复发率一直是外科医生研究的难点所在。肿瘤切除完整性、肿瘤数目、血管浸润和淋巴结转移是影响术后长期生存的主要因素。为改善预后,提高手术效果成为外科医生一直以来探索的目的。分子影像学的发展为提高手术效果提供了创新又有效的方法。ICG荧光显像技术能够提高原发性肝癌的R0切除率并有能力发现新的癌性病灶,从而有可能降低复发率,改善预后。然而仍然缺乏更多的设计良好的前瞻性临床研究来证实该技术对肝癌患者的生存率及复发率等患者预后的影响。由于这项新技术应用于临床不久,也缺少相应的临床应用规范。同时术中超声已广泛应用于临床,其能够准确定位肿瘤,识别肿瘤边界及与周围血管、胆管的解剖关系。能够发现术前影像学检查中难以发现的小病灶和瘤栓,帮助制定手术方案,引导肿瘤切除。其部分功能与荧光导航技术相同,所以二者在相同的功能方面的价值目前仍缺少严格的病例对照研究来提供数据依据。胆管细胞癌以及肝外胆管癌不能被ICG特异性显像也限制了其在临床上的扩展使用价值。为了推进该项新技术的临床应用规范化并解决以上临床问题,本研究通过ICG荧光导航肝脏肿瘤切除术的前瞻性研究,探讨该技术对于原发性肝癌患者预后的影响;通过和术中超声比较探讨该新方法的术中的具体使用方法及价值;同时通过设计新的分子探针Cy7.5-RGD/MSNs以特异性结合胆管癌组织,从而有望将分子影像学方法应用于胆管癌手术中,提高胆管癌的手术治疗效果。方法(1)选取我院肝胆外科2014年10月到2015年3月原发性肝癌拟行肝脏肿瘤切除术的连续的患者103例,随机分成荧光导航组和常规手术组,荧光导航组采用荧光导航技术引导术者引导肝脏肿瘤切除术,常规手术组作为对照则采用常规的手术方法进行肝脏肿瘤切除术,两组患者随访至2019年1月1日,记录患者围手术期以及术后短期和长期的复发情况及死亡情况。然后通过统计学分析,探讨ICG荧光显像技术对原发性肝癌患者手术治疗效果的价值。(2)选取我院肝胆外科指定时间段原发性肝癌拟行肝脏肿瘤切除术的连续的患者50例,随机分成荧光导航组和术中超声组,荧光导航组采用荧光导航技术引导肝癌切除的25例,术中超声组完全采用术中超声引导手术切除25例,记录二者对术前已知肿瘤的完整切除率以及发现新的癌性病灶的能力,通过统计学分析获得二者的对比数据差异,探讨二者在原发性肝癌手术切除术中的价值。(3)以胆管癌组织高表达的整合素αVβ6为靶点,以及整合素αVβ6的特异性结合多肽为理论支撑,设计一种新型的荧光分子探针Cy7.5-RGD,通过探索合成制备探针的方法,分子探针的化学表征检测描述,细胞毒性实验,靶向特异性体外评估实验,荷瘤裸鼠体内代谢方法以及探针在体靶向效果等实验以探讨新的分子探针各项指标的基础研究。(4)选取我院肝胆外科指定时间段拟行肝外胆管癌根治性切除手术的患者37例,对胆管癌切除后的新鲜标本进行探针喷洒、浸泡冲洗,然后采用荧光显像技术进行成像,记录肿瘤组织以及正常胆管组织的成像结果,和区分肿瘤的病例数,组织标本送病理检查,并根据免疫组化结果将根据整合素αVβ6高表达和低或不表达分成两组,统计学分析荧光显像技术对肿瘤的检出率以及对整合素αVβ6的检出效能。结果(1)①研究结果显示,荧光导航组离体标本肿瘤距离肝切缘的最短距离统计中,癌组织紧邻肝断面(<0.1cm)2例(4.0%,2/50),常规手术组为8例(16.7%,8/48),二者比较具有统计学差异。常规组中癌组织紧邻切缘与否的两组患者之间生存率比较中术后3个月的生存率有明显的区别。②两组98例患者随访至2019年1月1日,荧光导航组和常规手术组两组整体生存时间(p=0.688>0.05)、无瘤生存时间(p=0.716>0.05)以及整体复发率(p=0.993>0.05)无统计学差异。说明荧光导航技术对原发性肝脏恶性肿瘤的整体复发率以及整体生存率并没有明显影响。两组术后6个月生存率比较有统计学差异(p=0.039<0.05)。两组术后2个月复发率(p=0.038<0.05)、3个月复发率(p=0.046<0.05)以及术后6个月复发率(p=0.046<0.05)对比有统计学差异。说明荧光导航技术能降低原发性肝癌的短期复发率,提高短期生存率。③肿瘤大小介于3cm～5cm之间的两组术后复发率对比:3 个月(p=0.026<0.05)、6 个月(p=0.009<0.05)、36 个月(p=0.017<0.05)有统计学差异;且肿瘤大小3cm～5cm之间的两组生存率对比:24个月(p=0.026<0.05)有统计学差异。而肿瘤<=3cm和肿瘤>5cm两组复发率和生存率无统计学差异。(2)①荧光导航技术对荧光导航组25例患者术前已知的病灶进行实时引导切除,肿瘤切除后离体标本切缘病理回报均无癌细胞残留。术中超声组25例患者肿瘤切除后离体标本切缘病理结果显示有1例离体标本切缘有癌细胞残留,其肿瘤完整切除率(R0)为96%(24/25),显微镜下残留(R1)为4%(1/25)。②离体标本切缘距离肿瘤最短距离均大于0.8cm,小于1cm的有1例(4%),大于1cm的24例(96%),术中超声切缘距离肿瘤最短距离平均0.1cm(0.1cm-3.2cm)。癌组织距离肝断面长度最短距离0.1cm(1例,4%),小于1cm的有7例(28%),大于1cm的18例(72%),与荧光导航组相比较有统计学差异(P=0.049)。③荧光显像技术对新的癌性病灶的检出效能为:灵敏性71.4%,特异性11.1%,假阳性率88.9%;而术中超声为:灵敏性42.9%,特异性88.9%,假阳性率11.1%。(3)C①采用TEM和SEM观察Cy7.5-RGD/MSNs分子探针,测出其水和粒径在75-135nm之间分布,平均约为93nm;紫外分光光度计UV-Vis检测靶向探针分子探针在808nm处的吸光度,证明探针在血清中的光稳定性良好;②探针组细胞存活率分别为:98.12±1.55%、96.21±2.10%、95.60±1.30%、97.44±1.87%、93.50±0.90%与对照组97.10±2.10%组间的细胞存活率差异无统计学意义(P=0.132>0.05),说明探针对细胞的生长没有抑制,具有良好的生物相容性;近红外体式荧光显微镜观察QBC939-GFP细胞摄取了探针,从而细胞内蓄积了探针产生荧光;③探针对胆管癌组织有靶向特异性,与正常组织对比明显,探针注射后48 h,滞留于肿瘤组织,120h时基本代谢完全,但是肾脏部位仍然有探针残留,说明探针大部分经肾脏延迟代谢。体外脏器检测与体内荧光分布实验结果一致。(4)除去实验失败的病例14例,剩下23例胆管癌患者,荧光能够区分肿瘤和正常组织的14例(60.9%)。免疫组化结果显示:癌组织中αVβ6高表达者16例(69.6%),低表达或不表达者6例(30.4%)。在胆管癌患者中的癌组织αVβ6高表达16例中,荧光探针能够区分肿瘤13例(81.3%),荧光能够诊断筛选αVβ6高表达的灵敏度81.3%,特异度85.7%。结论(1)通过分析结果数据显示,基于ICG的荧光导航技术能够在离断深部肝实质时更好地确保肿瘤切除的安全距离;肝癌切除术后离体标本肿瘤紧邻肝切缘是术后短期内生存率的重要危险因素;荧光导航技术能降低原发性肝癌的短期复发率,提高短期生存率;该项技术对肿瘤大小介于3cm～5cm之间的原发性肝癌患者的复发率和2年生存率有价值。该项技术能够通过提高原发性肝癌的手术效果,并最终降低了原发性肝癌患者的短期复发率,提高了短期生存率。(2)说明荧光导航技术能够更好地确保肿瘤距肝切缘的安全距离,且能够提高肿瘤的R0切除率。并且荧光导航技术能够作为术中超声切除肿瘤的补充切缘探测,最终病理结果显示术中超声组25例患者均达到了 R0切除的效果。荧光导航技术在探测新的癌性病灶的能力上比术中超声有较高的灵敏度,对癌性病灶检测更加全面,但是较高的假阳性率仍然是需要进一步研究避免的方向。通过联合荧光导航技术和术中超声共同探测剩余肝脏,两者互相弥补不足,可达到更高的癌性病灶检出率。(3)合成制备了能够特异性结合整合素αVβ6的探针Cy7.5-RGD/MSNs。经理化实验检测,该探针具有良好的生物相容性,光稳定性,高水分散性以及荷瘤裸鼠的较高的靶向性。(4)通过结果分析以及临床应用方法的探索,新型分子探针Cy7.5-RGD/MSNs能够特异性靶向胆管癌新鲜组织,而正常胆管不显像,从而达到了区分胆管癌与正常胆管的目的。尤其是在整合素αVβ6受体高表达的胆管癌组织中,该分子探针显示出了高特异性,有望成为一种新的指导术中胆管癌组织荧光成像的新探针与新技术。