兔病毒性出血症是由兔病毒性出血症病毒(RHDV)引起的兔的一种急性、败血性和高度致死性传染病,也是对养兔业构成严重威胁的重要传染病之一。国外研究表明,RHDV已呈现出变异趋势,给RHD的防治带来新的难题。为探讨我国RHDV在过去20年间是否也出现了遗传变异情况,以及其与国外分离株之间遗传演化关系。本研究以核衣壳蛋白(Vp60)为靶基因,对浙江省农业科学院动物病毒研究室保存的1989～2006年间的8株RHDV进行了序列测定,同时利用分子生物学软件,将其与国内、外RHDV的Vp60进行了序列比对和分析,并绘制了系统发生树。结果表明,所有RHDV分离株的VP60基因均由1740个核苷酸组成,编码580个氨基酸。它们与参考序列之间的氨基酸同源性为94.0%～99.8%。系统发生树分析结果显示,所选的RHDV分离株可分为2个基因群,每个基因群又可分别分为两个亚群,其中中国分离株主要坐落于C亚群中,与欧洲分离株的遗传距离比较近。基因群之间的遗传距离有逐渐加大的趋势,提示我国RHDV在长期流行与演化过程中存在一定的遗传变异趋势。本研究结果对于制订有效的RHD防治措施将有一定的参考意义。由于RHDV是一种传染性较强的II类病原,在普通环境中操作和研究该病毒,存在较大的生物安全隐患。此外,RHDV是一种RNA病毒,要开展该病毒的基础研究,必须具备一个便于在DNA水平操作的技术平台,即反向遗传操作系统。鉴于此,本研究在前期构建RHDV侵染性克隆基础上,应用定点突变技术,分别在含有RHDV全基因组cDNA序列的重组质粒pBlRHDV的VP60基因两端,引入限制性内切酶识别位点NarI,用NarI酶消化删除衣壳蛋白编码区,保留了RHDV复制所必需的所有蛋白酶基因和两端的非编码区,成功构建RHDV复制子。然后,将构建好的RHDV复制子用NruⅠ线性化,采用RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems- SP6系统进行体外转录,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果表明体外转录物RNA完整。用脂质体转染法将转录物RNA转染RK-13细胞,24h后可观察到典型的RHDV致细胞病变效应,收集细胞培养上清提取RNA,RT-PCR方法检测病毒基因组和病毒复制过程中的负链RNA,以及间接免疫荧光检测复制子的表达,结果表明RHDV复制子在RK-13细胞中能够正常表达和复制,此外还提示衣壳蛋白是RHDV维持侵染性所必需的结构蛋白。本研究为在常规实验环境中开展RHDV的应用基础提供了一个安全而有效的技术平台,同时也为研究新型载体和新型基因工程疫苗奠定了物质基础。