论文部分内容阅读
捻转血矛线虫病是由捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)引起的、重要的反当动物胃肠道寄生线虫病。该病分布广泛,危害严重。捻转血矛线虫也是一种重要的消化道寄生线虫模式种,对其与宿主间相互作用的研究,有助于揭示消化道线虫影响宿主免疫反应及引起免疫逃避的具体机制。由寄生性线虫等蠕虫排泄分泌的半乳糖结合凝集素(galectin)能够显著调节宿主的免疫反应。本实验室从捻转血矛线虫雄虫和雌虫体内分别克隆得到一种galectin,命名为Hco-gal-m(GenBank No.AY253330)和Hco-gal-f(GenBank No.AY253331)。研究表明,重组Hco-gal-m/f(rHco-gal-m/f)能对捻转血矛线虫感染提供部分的免疫保护力;rHco-gal-m/f能与山羊外周血淋巴细胞结合,参与调节宿主细胞多种细胞因子相关信号通路,抑制细胞因子的分泌;同时影响细胞的分化和迁移,诱导细胞调亡。这些结果提示Hco-gal-m/f直接参与了宿主免疫反应的调节,参与虫体的免疫逃避。然而,Hco-gal-m/f与宿主细胞的哪些受体蛋白结合,之后活化或调节了哪些相关信号通路从而引起宿主免疫反应的具体分子机制还不清楚。因此,对Hco-gal-m/f在山羊外周血淋巴细胞上膜受体的筛选及研究,有助于阐明Hco-gal-m/f与宿主细胞相互作用和寄生虫-宿主相互作用的分子基础及作用机制。1酵母双杂交系统的构建为了研究Hco-gal-m/f与宿主细胞间相互作用的分子机制,在研究中首先构建了分裂-泛素酵母双杂交系统。从山羊外周血淋巴细胞中提取并纯化总RNA,合成第一链cDNA,再通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到双链cDNA，同时在cDNA两端加上接头。用限制性内切酶Sfi I处理cDNA,将其插入文库质粒pPR3-N,电转化重组质粒进入大肠杆菌DH10B,建成原始文库。对原始文库进行扩增,PCR鉴定重组质粒内插入片段的大小。之后构建了两个诱饵重组质粒pDHB1-gal-m和pDHB1-gal-f,并检验了Hco-gal-m/f在酵母中的表达,确定其能够用于酵母双杂交筛选。实验结果表明,提取的总RNA分子完整,纯度高;成功合成双链cDNA。文库质粒中插入片段大小分布在500～2500bp,平均长度约为1000bp。原始文库滴度达到1×106cfu/mL,扩增后的文库滴度为1×109 cfu/mL。所构建文库的各项指标均达标,可以用于筛选Hco-gal-m/f的结合蛋白。2 Hco-gal-m/f结合蛋白的筛选及验证使用研究初期构建的酵母双杂交系统进行营养缺陷筛选,共获得81个阳性克隆。阳性克隆经过一轮返板验证,最终得到能与Hco-Gal-m/f结合的三个蛋白:TMEM147(transmembrane protein 147)、SERP1(Stress-associated endoplasmic reticulum protein 1)和TMEM63A(transmembrane protein 63 A)。为了进一步验证Hco-Gal-m/f与候选蛋白的结合,本研究中使用免疫共沉淀技术,从两个方向检验了rHco-Gal-m刺激12h后的山羊外周血淋巴细胞中这三个蛋白与Hco-Gal-m的结合。结果表明,Hco-Gal-m能够与PBMC中的TMEM147、SERP1和TMEM63A发生特异性结合。此结果进一步证实了TMEM147、SERP1和TMEM63A是Hco-Gal-m在山羊外周血淋巴细胞上结合蛋白。这三个结合蛋白的发现有助于阐明线虫galectin与宿主间相互作用的机制。3 Hco-gal-m/f结合蛋白的定位及功能研究研究中的免疫荧光实验结果显示TMEM147分布于细胞膜上和细胞内,SERP1分布于细胞内,而TMEM63只分布于细胞膜上。流式细胞检测结果表明这三个蛋白在绝大多数的山羊外周血淋巴细胞上均有表达。细胞经RNA干扰后的免疫共沉淀实验进一步证实TMEM147、SERP1和TMEM63A是Hco-gal-m/f的结合蛋白及膜受体。细胞经RNA干扰后进行的细胞因子转录及分泌检测表明rHco-gal-m与TMEM147、SERP1和TMEM63A的结合参与调节了TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-4、TGF-β1和IL-17等细胞因子的表达。本研究第一次证明TMEM147和TMEM63A是Hco-gal-m/f的膜受体,SERP1是Hco-gal-m/f的结合蛋白;Hco-gal-m/f与这三个蛋白之间的结合参与调节了宿主细胞的免疫反应。