机体免疫应答过程的复杂性和严格的调控性，是由多种免疫细胞和免疫分子共同参与而完成的。而免疫应答的核心是T淋巴细胞的活化。研究表明，诱导T淋巴细胞活化、增殖及分化为效应细胞需要双信号刺激：第一信号来自抗原由TCR转导并由粘附分子增强；第二信号即协同刺激信号由APCs表面的协同刺激分子和T细胞的相应受体相互作用后产生。协同刺激分子主要分为免疫球蛋白超家族、TNF／TNFR超家族及细胞因子超家族三种。B7／CD28属于免疫球蛋白超家族，其提供的第二信号，是迄今为止公认的最基本的协同刺激信号。B7家族分子属于免疫球蛋白超家族，其成员主要有B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、B7-H1(PD-(?)1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(GL50)和B7-H3等，主要表达于树突状细胞、单核细胞、朗格汉斯细胞、巨噬细胞和B细胞等抗原递呈细胞(APC)表面。但近年来的研究证实，部分B7家族分子还表达于关节炎病人的关节腔T细胞、系统性红斑狼疮患者的外周血T细胞、DC与T细胞共培养一段时间后的T细胞表面。CD28分子为Mr．44KD的同源二聚体组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白。1980年首先由Hansen等用单克隆抗体发现，随后将人的CD28分子基因克隆并表达，主要表达于9596的CD4~+T细胞和50％的CD8~+T细胞、活化的T细胞、成熟胸腺细胞和部分NK细胞等。与其天然配体CD80／CD86分子结合形成的协同刺激信号，在免疫应答的早期发挥重要作用。其在降低T细胞活化阈值、调节细胞迁移和Th1／Th2分化、诱导抗凋亡基因Bcl-XL表达、增加细胞因子IL-2的分泌、促进免疫突触形成及阻止T细胞失能等方面均具有重要作用。对该信号进行选择性调控，可促使机体对肿瘤的排斥和肿瘤细胞的杀伤，有助于自身免疫性疾病或超敏反应及异体器官移植排斥的防治。另外，可溶性CD28分子在免疫应答和免疫调节中发挥何种作用，在肿瘤、免疫缺陷病、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的发生、发展、转归中又鼠抗人CD28分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学的特性的鉴定中文摘要有何意义，目前仍不清楚。因此，CD28功能性单克隆抗体的研制及可溶性CD28分子检测方法的建立，为CD28及相关协同刺激分子的:基础研究和肿瘤、移植排斥反应、自身免疫性疾病等临床应用研究提供重要手段。1.CO28单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究1 .1杂交瘤细胞的建株及亚类鉴定 以天然高表达CD28分子的人多发性骨髓瘤细胞株U266作为免疫原，经丝裂霉素(MMC)处理(50 pg/1 X10，细胞)后，免疫BALB/C小鼠，分颈部、皮下多点及腹腔注射。采用B淋巴细胞杂交瘤技术，将免疫后的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SPZ/0进行融合。以小鼠恶性淋巴瘤细胞转人CD28基因细胞株CD28一T作为筛选细胞株，同时以转基因细胞的母本细胞及不表达CD28分子的OaUdi细胞作为阴性对照细胞株，经HAT培养、间接免疫荧光分析和多次的克隆化培养及反复筛选，在融合的72块96孔板中，最终获得5株持续、稳定分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2D5、2F5、3B6、3F8和8G8。经快速定性试纸分析法鉴定，5株单抗中的2D5属小鼠IgGZa亚类，其余均为工gGI，正类。经体外连续传代培养，液氮冻存半年以上，复苏后仍生长良好，分泌抗体的忆有旨稳定。1.2单克隆抗体的制备、纯化及效价测定 采用本室建立的体内腹水诱生法制备单克隆抗体。将生长良好的杂交瘤细胞注入经Pri stane预致敏的BALB/C小鼠腹腔。5~10天后收获腹水，离心后收集含有单抗的上清。小鼠腹水阳性形成率为900k以上，腹水收获量平均为7.4ml/只，个别小鼠达25ml/只以上。经ProteinG亲和层析法纯化抗休，抗体蛋白含量在1.2一4.7mg/m1腹水之间。将腹水型单抗、杂交瘤培养上清和纯化后mAb用PBS梯度稀释后，与U266细胞反应，间接免疫荧光法分析，以出现同样阳性率的最大稀释倍数或最小蛋白浓度为抗体的效价。结果表明，培养上清中单抗效价为l:200以上，腹水型单抗效价为l:2000以上，纯化的抗体蛋白用于间接免疫荧光分析的用量为0.5 pg/5 x IJ细胞。1.3单抗识别的抗原位点及对不同细胞株膜型CO28分子的识别 采用竞争抑制结合试验，2D5和8G8能完全阻折阳性对照直标单抗CD28一FITC与U266细胞的结合，表明2D5和8G8与阳性对照单伉识别相同或相似的抗原位点;其 鼠抗人CD28分子功能性单克隆抗体的研制及其生物学的特性的鉴定中文摘要余3株能部分阻断对照单抗与U266的结合，提示该3株单抗与阳性对照单抗识别不同或不完全相同的抗原位点。 将生长良好、高表达CD28分子的人多发性骨髓瘤细胞株U266和XGI、新鲜分离的外周血单个核细胞(PBMC)、T恶性淋巴瘤细胞株J盯kat和转基因细胞CD28一T分别与抗体反应，通过间接免疫荧光法和流式细胞仪(FCM)分析，结果显示，5株单抗均能良好地识别表达在不同细胞上的CD28分子，1 .4单抗对pB丁C的激发效应及活化T细胞的表型分析 采用CD28单抗联合激发型CD3单抗激发PBT〔(通过Fic011密度梯度法和磁珠阴性选择去除CD19、CD56阳性细胞即B细胞和NK!扭胞后获得)。鼠抗人CD3单抗(0、5pg/ml)包被96孔板，100 pl/孔，吸去包被液，PBS洗涤2遍。用含15%FCS的RPMI 1 640