莪术油诱导卵巢癌上皮细胞系凋亡及其对STAT信号传导通路的影响

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目的:卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率据妇科恶性肿瘤之首。由于其起病隐匿且缺乏早期诊断手段,大多数患者初次就诊时已发展为卵巢癌晚期,甚至广泛转移,手术已不能完全去除,目前,肿瘤细胞减灭术及术后联合化疗是目前公认的治疗方法。以顺铂为基础的化疗是治疗卵巢癌的常用药物,但在治疗过程中约80%患者表现出不同程度的获得性耐药,严重影响患者的预后[1-2]。因此,如何利用新的敏感的药物设计出抗肿瘤活性最佳,而毒性及耐药性最小的联合化疗方案,进而提高卵巢癌患者的生存率和生活质量,是我们深入研究的重点。莪术油是从姜科植物莪术的干燥根茎中提取的挥发油成分。莪术中富含挥发油,且成分相当复杂,主要化学成分为β-榄香烯、莪术醇、莪术酮、新莪术二酮、樟脑等[3]。其具有很好的抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗血栓形成和调节免疫功能等[4-6]广泛的生物学效应,尤其是其抗肿瘤作用受到广泛关注。有研究证实,莪术油对胃癌,肝癌,宫颈癌,子宫内膜癌细胞等有抑制作用,但莪术油对化疗耐药的卵巢癌是否有作用目前尚未见报道。研究认为STAT3信号传导通路及其调控的下游靶基因可以作为肿瘤对化疗耐药的标志[7-9]。本实验拟通过体外实验将莪术油作用于人卵巢癌上皮细胞SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP观察其对细胞增殖的影响,是否可逆转卵巢癌顺铂耐药细胞对顺铂的耐药性,并初步探讨其对STAT信号传导通路的影响,为耐药性卵巢癌的临床治疗提供理论和实验依据。方法:(1)细胞培养:体外培养人卵巢癌上皮细胞SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP24小时后,加入不同浓度的莪术油,采用细胞形态学观察、HE染色法观察细胞形态学变化。(2)分别加用16、32、64、128、256μg/ml莪术油作用于卵巢癌细胞SKOV3和SKOV3/DDP,同时设立空白对照组,培养24,48小时后,利用噻唑蓝比色法(MTT)法检测不同浓度莪术油对细胞SKOV3及SKOV3/DDP增殖抑制情况。(3)顺铂,莪术油及其联合应用于SKOV3/DDP24小时,利用免疫组织化学法检测细胞信号通路中STAT3及Survivin、 Caspase-3、VEGFCmRNA蛋白的表达变化情况。(4)半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定STAT3及其转录激活因子Survivin、VEGFC和Caspase-3的表达情况。结果:(1)倒置显微镜及HE染色观察细胞形态学变化:对照组生长旺盛,形状规则,呈梭形;加药组见胞数量明显减少,细胞间隙变大,细胞体积胀大,颗粒增多,包膜不清。(2)不同浓度莪术油对卵巢癌细胞SKOV3和SKOV3/DDP细胞增殖的影响:随着药物浓度和作用时间的增加,抑制率明显增高,具有明显的剂量-时间效应关系,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)免疫组化法检测莪术油作用于SKOV3/DDP细胞24h后相关基因表达变化情况:STAT3、Survivin、VEGFC表达下调、Caspase-3表达增高(4)RT-PCR测定显示:顺铂,莪术油及其联合应用顺铂作用于卵巢癌细胞后STAT3、Survivin、VEGFC吸光度比值下降,Caspase-3吸光度值增高,P<0.05差异有统计学意义。结论:(1)莪术油对卵巢癌细胞SKOV3,SKOV3/DDP有明显的增殖抑制作用;(2)莪术油联合顺铂可以协同诱导SKOV3/DDP凋亡,在凋亡发生过程中可能通过下调STAT3,Survivin,VEGFC的表达,上调凋亡相关基因Caspase-3蛋白的表达发挥作用。(3)STAT3、Survivin蛋白表达水平与卵巢癌顺铂耐药相关,其表达越高对顺铂敏感性越差,莪术油可提高卵巢癌顺铂耐药细胞对顺铂的敏感性。(4)Spearman相关系数分析结果显示Survivin,VEGFC,Caspase-3的表达变化与STAT3的表达具有相关性,P<0.01差异有统计学意义。
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