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研究目的葡萄膜黑色素瘤(Uveal Melanoma,UM)在世界范围内是成年人最常见的原发性眼内恶性肿瘤,具有高度恶性,易远处转移的特点。虽然近年来对UM的局部控制手段在不断改善,但是患者的总生存期并未见显著提高。SKP2被认为是涉及多种恶性肿瘤发生的原癌基因。SKP2蛋白可通过特异性识别细胞周期调节因子并介导其泛素化和蛋白酶体降解来深刻地影响细胞周期。SKP2失调是许多癌细胞的特征。然而,其在葡萄膜黑色素瘤中的作用尚未阐明。本研究旨在验证SKP2在UM发生中的功能和作用机制,探索使用小分子药物靶向抑制SKP2以控制UM肿瘤发展的可行性,为加深对UM发病机制的了解和开展UM靶向治疗提供新的证据和启发。研究内容和方法1.通过RNA-seq发现,并用Real-Time PCR和蛋白质印迹法技术分析SKP2在不同UM细胞系与正常表皮色素细胞中表达的差异。2.使用siRNA技术敲低OM431和MUM2B细胞系中SKP2的mRNA表达水平,并通过细胞增殖试验和平板克隆形成试验检测其在UM中的作用。3.通过IC50测定试验和平板克隆形成试验评估UM及正常表皮色素细胞对SKP2抑制剂C1(SKPin C1)的体外敏感性,并使用基于裸鼠的异种移植模型验证MUM2B细胞在体内对SKPin C1的敏感性。4.通过蛋白质印迹法和免疫沉淀试验检测SKPin C1处理后的UM细胞中p27含量及其泛素化水平的变化。研究结论1.与正常色素细胞相比,SKP2的mRNA和蛋白质水平在UM细胞中显著高表达。2.SKP2基因敲除可以导致UM细胞增殖和克隆形成能力明显下降。3.靶向SKP2的小分子抑制剂SKPin C1,其在体内和体外均可抑制UM细胞的生长。4.SKP2靶向抑制剂C1通过阻断p27的泛素化来减少p27的降解,导致UM细胞中p27的积累和细胞周期阻滞。研究成果1.发现SKP2在UM中过表达,且具有促肿瘤作用,SKP2沉默可以抑制UM的生长。2.验证了UM中SKP2的靶向干扰造成肿瘤在体内外的生长抑制,并且该作用是通过减少p27泛素化降解导致细胞G1期阻滞的机制来实现的。