论文部分内容阅读
Dpp基因是昆虫发育过程中的关键基因,最早在果蝇中发现并进行研究。目前,果蝇dpp基因的功能已经研究的比较清楚。在果蝇胚胎发育初期,dpp基因编码的蛋白参与胚胎背-腹轴的分化,之后在胚胎体节分化的过程中指导胚胎体节间隔的形成,并作为胚胎发育基因wingless和hedgehog的下游基因,决定将来附属肢的发育位置,包括翅、腿和触角。另外,dpp编码一种器官形成素因子,指导果蝇翅膀的形成在眼睛发育过程中指导果蝇复眼视网膜的形成。
Dpp基因在物种间具有广泛的保守性。在果蝇中发现之后陆续在其他昆虫、线虫、爪蟾、低等真核生物,乃至高等哺乳动物中发现其同源基因。我们在家蚕基因组数据分析中也发现了却的同源基因。家蚕是重要的模式生物之一,其胚胎发育研究具有重要意义。为了研究家蚕的胚胎发育调控机制,本论文对家蚕中dpp的同源基因进行了初步的研究,本研究的内容与结果如下:
(1)利用家蚕EST数据克隆了果蝇dpp基因在家蚕中的同源基因Bmdpp,其克隆的mRNA全长1437 bp,CDS长1146bp,编码381个氨基酸的蛋白,预测分子量为38.6kD,等电点为9.18,含有TGFb propeptide和TGFB结构域。氨基酸序列比对分析表明Bmdpp蛋白质与果蝇dpp蛋白质的氨基酸序列相似性达到45%,将mRNA序列与家蚕基因组序列比较表明,Bmdpp在5,端有选择性剪切,两种剪切形式的mRNA都由2个外显子和1个内含子组成,且所有的外显子/内含子拼接边界均符合经典的GT-AG规则。
(2)为了研究Bmdpp基因在家蚕各组织和各个发育时期的表达情况,以家蚕脂肪体、丝腺、中肠、体壁、头部、精巢、卵巢cDNA和从未受精卵到受精8天的不同胚胎发育时期的卵为模板进行RT-PCR扩增。RT-PCR结果表明Bmdpp基因在所检测的家蚕各组织均有表达;在对不同胚胎发育时期表达情况的调查发现,Bmdpp在绝大部分时期都高量表达,在受精6h-14h表达量很低,甚至没有表达。这一表达模式和果蝇dpp基因在胚胎发育过程中的表达模式相似,推测Bmdpp在家蚕早期胚胎发育背.腹轴的分化中起作用。 (3)以pET-28a(+)为表达载体,gCiBmdpp基因完整CDS序列亚克隆到pET-28a(+)表达载体,构建成重组表达质粒,转化到BL21表达菌株,挑取单克隆先在24℃下振荡培养,当OD值达到0.6时加入终浓度为1 mM的IPTG,在37℃ 240rpm/min诱导4,b时,以转化有pET-28a(+)空载体的菌和未诱导的转化菌为对照,经SDS-PAGE电泳诱导菌出现约40 kD的目的蛋白带,说明该基因编码的蛋白得到表达。