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胚胎分割是胚胎工程的一项重要技术,可用于扩增可用优良胚胎的数目和生产同卵双胎、同卵多胎的遗传性状一致的动物。本课题对小鼠的胚胎分割和奶牛胚胎的分割与半胚移植进行了系统的研究。
小鼠是常用的动物模型,它生殖周期短,廉价易得。首先对小鼠的胚胎进行徒手分割,研究在不同分割液中采用不同的分割工具和分割方法,分割不同发育阶段、不同质量的胚胎,并对透明带进行处理后分割。结果除囊胚的分割成功率显著高于桑椹胚外(91.9%,96.2%)(P<0.05),其他各因素对胚胎分割的成功率没有显著差异。
分割后的半胚体外培养,在半胚发育方面:1.不加血清PBS液组(77.5%)显著低于保存液、0.2M蔗糖PBS液、进口分割液组(82.3%、84.8%、83.5%)(P<0.05);2.分割针组(83.7%)显著高于分割刀组(77.6%)(P<0.05);3.桑椹胚组(80.8%)显著低于囊胚组(85.2%)(P<0.05);4.去除透明带组(77.7%)与透软化组、不处理组(81.9%、82.8%)均有显著差异(P<0.05);5.A级胚胎组(84.8%)显著高于B级胚胎组(73.2%)(P<0.01);6.二分胚的胚胎发育数(84.1%)显著高于四分胚组(68.8%、64.1%)(P<0.01);7.鲜胚组(84.1%)显著高于冻胚组(753%)(P<0.05)。
结果表明:各因素对于胚胎分割成功率没有显著的影响。其影响主要表现在半胚的发育率方面。通过试验可以看出,在体视显微镜下,用玻璃分割针在0.2M蔗糖PBS液或分割液中直接对胚胎进行徒手分割,可获得很高的分割成功率和半胚发育率。
本实验还对分割的半胚进行冷冻,研究不同冷冻方法、冷冻前培养时间和解冻温度对半胚冷冻效果的影响。结果采用常规冷冻方法,在冷冻液中加入10%T-500,效果良好;冷冻前培养1小时效果最好,与培养2小时差异不显著,两组显著好于3小时组;在30℃水浴解冻效果良好。结果表明,在半胚冷冻前培养时间及冷冻方法、冷冻保护液对冷冻半胚的发育有显著影响。
通过对小鼠胚胎分割技术的研究,建立了胚胎分割技术平台,在此基础上对奶牛胚胎进行分割与移植。本实验应用FSH对高产荷斯坦奶牛进行超数排卵,并对胚胎进行分割和半胚移植,同时分割冷冻胚胎和玻璃化冷冻性控胚胎。比较了国产FSH和进口FSH的超排效果,研究了新鲜胚胎、冷冻胚胎和玻璃化冷冻性控胚胎的分割成功率,并对半胚进行移植,探讨移植单半胚与双半胚对妊娠率的影响。结果无论采用进口还是国产的FSH对供体进行超数排卵处理,差异不显著。移植不同性质胚胎的半胚和双半胚,新鲜胚胎的半胚,双半胚的移植妊娠率显著高于常规冷冻胚胎、玻璃化冷冻性控胚胎(62.5%,16.7%,42.9%)(P<0.05),半胚与双半胚的移植妊娠率差异显著(62.5%,42.9%)(P<0.05),总的半胚胚胎的妊娠率与对照差异不显著(53.3%vs50.%)(P>0.05)。结果表明,胚胎分割对于妊娠率的影响差异不显著,但是可以显著提高胚胎的利用率,有利于优秀种群的扩繁。