研究背景及目的目前乳腺癌在世界上最普遍发生的恶性肿瘤中占据一席之地,其发病率近二十多年来不断攀升为女性癌症中第一位,对女性癌患的生命健康造成很大威胁。当前乳腺癌被广泛认为是一类在病理形态上均具有高度异质特性的病症,肿瘤的发生和早期进展以及转移是导致癌患预后水平较低的主要原因。对于晚期原发性乳癌患者而言,接受放射治疗仍是必要的减少复发的一项局部辅助性治疗方式。然而,部分乳腺癌患者在接受放疗时,常常发生癌组织对射线敏感性弱而拉低预期疗效的现象,因而增强肿瘤对射线的敏感性,提高肿瘤放疗的治疗效益比依然是现代临床医学里亟需全力解决的重要问题之一。临床上,乳癌性质可根据癌组织中标志蛋白分子状态分作几类分子亚型,其中激素受体状态呈阳性的乳癌患者通常表现为雌激素受体(estrogen receptor,ER)和、或孕激素受体(progesterone receptor,PR)表达阳性。Palbociclib是一种针对周期依赖酶CDK4/6分子的新型选择性靶向药剂,其与来曲唑联合用作为转移性乳癌晚期患者的一线方案施治被证实可取得可观的治疗效果。在细胞和分子研究水平,许多研究证明palbociclib能够协调内分泌药物及化疗药物抑制雌激素受体表达呈阳性状态的乳癌增殖和进展转移的作用,但其在放疗干预方面的具体影响及相关机制仍然不清楚。通过对本课题的研究,我们希望确定乳腺癌中palbociclib对放疗的影响,确定其对乳腺癌放射治疗是否有增敏作用,并初步讨论其潜在的作用机制,希望能为放疗的临床干预方面提供一定思考。研究方法用呈梯度药浓度的palbociclib处理两种ER表达呈阳性状态的乳癌细胞(MCF-7和T47D),借助细胞毒性实验来确定该药对细胞有效的作用浓度(IC50)。将经4 μM palbociclib预处理的实验组细胞和DMSO处理的对照组细胞分别置于梯度剂量的X射线下进行照射后(0,2,4,6,8 Gy),铺入细胞培养皿和细胞培养板中,在标准条件下培养一定时间,在固定时间点截取细胞进行观察,通过克隆形成、彗星迁移、免疫荧光染色实验测定细胞增殖能力和DNA损伤修复能力的表型状态及其变化。克隆形成实验中,统计符合标准的克隆并根据公式得到克隆形成率,采用线性二次模型进行克隆形成曲线绘制。彗星实验中拍摄胞核的荧光染色情况,观察DNA迁移(彗星尾)的观测长进而判定癌细胞个体DNA受损状态。对乳癌胞核中γ-H2AX作免疫荧光试验检测,细胞接种在飞片上后经4 μM palbociclib预处理24h后接受X线暴露(4 Gy),在预定节点(0h,0.5h,4h和12h)截取细胞完成荧光染色操作,并且于荧光显微镜下观测癌细胞接受X线暴露处理后γ-H2AX焦点形成与持续状态,从而判定乳癌细胞DNA损伤后的修复表型受药物作用影响的变化。通过流式细胞术测定两种乳癌细胞的周期进程,通过比较确定有无palbociclib预处理是否造成放疗后乳癌细胞周期占比的变化。将乳腺癌细胞分为放射亚组及palbociclib联合放射亚组(分别用DMSO或4μM palbociclib预处理乳腺癌细胞24h),两亚组各自接受4 Gy X线辐照,于12h时间节点截获测定。按照操作步骤说明处理后用流式仪检测吸取细胞所处不同周期的比例分布变化,并用专业软件ModFit对所得结果作出拟合和计算。在此基础上,从GEO共享数据集中分别下载条件处理后的检测表达谱(网址是 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),分别是经 palbociclib 处理的乳腺癌细胞测序数据集GSE117742,GSE117743和经放射处理的乳腺癌细胞转录组测序数据集GSE102798,借助GE02R在线分析工具寻找差异表达基因。我们对结果数值相差较大的基因集作功能性的富集分析,以期发现并挑选显著富集的癌相关通路。此外,通过数据集取交集找到受palbociclib和X射线双因素调控的交集候选基因。进一步,我们登录TCGA库获取乳癌患者组织测序的三级数据,通过生物信息学分析和基因线性共表达分析确定与palbociclib靶点CDK4/6表达共相关的候选作用基因。为验证预测的候选基因ARL4C与CDK6之间的表达相关性,我们设计ARL4C特异性引物序列,借助聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)来进一步实验验证;同时,我们构建目的基因ARL4C过表达的载体系统并经脂质体包被转染到乳腺癌细胞系中,通过western-blot实验验证其与CDK6的表达相关性。在此基础上,我们借助Western-blot验证交集基因富集的DNA损伤和细胞周期相关通路,进一步测定palbociclib对两组细胞内DNA损伤修复参与酶和周期检查点相关分子的作用。用4 μM palbociclib预先作用24h后对乳癌细胞作梯度剂量X线暴露,48h收取两亚组的分子蛋白,测定Ku70,Ku86和RAD51的表达情况。此外,用palbociclib预处理乳腺癌细胞24h后进行X线暴露,48小时后收取对照组、palbociclib作用组、X线暴露组以及经palbociclib预处理的X线暴露组共四个亚组,检测周期有关蛋白分子的变化。结果通过克隆形成实验中观察克隆形成与结果统计,我们发现palbociclib对实验亚组的雌激素受体表达呈阳性状态乳癌细胞(MCF-7和T47D细胞)具有显著的放疗增敏影响。与未经palbociclib预处理的对照组细胞相比,在接受同等剂量X射线照射的情况下,经palbociclib预处理的实验组细胞表现出明显减弱的增殖能力,生存分数(SF,survival fraction)明显降低(p＜0.01)。在MCF-7和T47D两种细胞系中均可观察到类似的结果。进一步分析数据用二次模型拟合细胞存活曲线,线性回归模型显示两条拟合曲线间计算存在明显的具有统计学意义的差异(p＜0.001)。彗星实验中,经palbociclib预处理的肿瘤细胞与对照组相比较经X射线处理后具有明显延长的DNA碎片迁移路径,经细胞自主DNA损伤修复20h后与对照亚组作比仍表现为延长的彗星尾巴迁移现象,表明DNA的受损程度是加重的,癌细胞恢复速度和程度均受阻。γ-H2AX是反应DNA损伤的敏感蛋白指标。与单X线处理的亚组作比,palbociclib联用X线的实验亚组表现为γ-H2AX分子焦点清除延缓和滞后。两种细胞在0.5h是均呈现较多数γ-H2AX荧光点,且跟对照亚组相比,经palbociclib预作用的MCF-7在4h时呈现为γ-H2AX焦点没有明显变少迹象,12h时仍未恢复至本底荧光水平;经palbociclib预处理的T47D乳腺癌细胞在0-12h检测中均表现较明显的γ-H2AX焦点表达,12h仍呈现明显要强于对照亚组水平的γ-H2AX焦点荧光表现。彗星实验结果显示palbociclib能协同X线增强对核DNA损伤破坏,免疫荧光实验结果表示出palbocicl ib可延缓X线造成的DNA断裂的修复进程,抑制乳癌细胞增殖。乳癌细胞经X线辐照后会产生G1到S或G2到M期的停滞,从而抑制恶性增殖和癌症进展。Palbociclib预处理亚组(MCF-7和T47D)跟对照亚组作比出现较明显变化,表现为细胞处在G0/G1的占比大幅度升高,而处于S期的比例显著减小(p＜0.05)。Palbociclib联合X线亚组与单X线亚组作比,X射线诱导G1/S期阻滞加强(p＜0.05)。进一步的,我们对三个GEO测序数据集的所有差异基因作功能性富集分析。结果显示差异基因在DNA损伤相关通路和细胞周期通路中呈显著富集状态。同时,我们通过交集找到受palbociclib和X射线双因素调控的共10个候选基因,可能作为palbociclib发挥增敏作用的下游靶点。通过线性共表达分析,我们发现乳癌预后有关基因ARL4C跟CDK6表达相关(r=0.60,p＜0.001)。分子生物学实验中,我们通过PCR实验发现ARL4C在乳癌细胞表达程度较低,且ER表达呈阳性状态的细胞里,过表达ARL4C在一定程度上可引起CDK6蛋白增多。这验证了 ARL4C与CDK6之间具有表达相关性,然而ARL4C对乳腺癌发展的具体调节作用和机制仍有待于进一步挖掘。我们进一步对功能性通路分析中表现显著的DNA损伤和周期有关分子通路作验证。DNA损伤修补可通过同源跟非同源两种重组方式进行,双链断损之后的修补是多分子共同作用的复杂过程,同源修补方式的主要催化参与者为Rad51,而Ku70和Ku86是参与非同源修补方式的主要蛋白。我们借助western-blot实验测定ER表达状态呈阳性的乳癌细胞内蛋白变化。随射线暴露剂量的增加,palbociclib可使MCF-7和T47D内参与同源重组的RAD51表达持续下调;同时,palbociclib联合放疗亚组较单放疗处理亚组细胞中RAD51水平显著下调,提示palbociclib可抑制的DNA损伤同源修复,增强X线特异性损伤乳癌组织细胞的作用力度。同时,单放疗处理的对照组中Ku70,Ku86及RAD51与放射剂量均无明显相关性,而palbociclib联合放疗实验组中RAD51蛋白表达与放射剂量具有一定相关性,提示palbociclib可增强乳腺癌细胞对X射暴露的敏感程度。此外,我们通过western-blot对周期有关通路的蛋白状态进行测定。两种乳腺癌细胞系中,与单palbociclib处理亚组和单放疗处理对照亚组相比,palbociclib联用X线亚组中p-Rb,p-erk与p21均明显下调,提示palbociclib可通过阻滞细胞周期增敏放疗,二者在乳腺癌细胞杀伤方面具有协同作用。结论Palbociclib能够通过阻滞周期增强ER表达呈阳性状态的乳癌细胞系对X线的敏感程度,加大X线对癌细胞的杀伤力度,主要可能机制为通过诱导G1/S周期阻滞,阻碍DNA修复酶的正常作用而使DNA修补受抑。此外,ARL4C跟CDK6具有表达相关性,提示ARL4C可能作为palbociclib增敏放疗的潜在靶点。综上,本课题为palbociclib作为放疗增敏剂在乳癌患者临床干预方面的应用提供了一定依据,这种联合应用可为乳癌患者的综合治疗提供新的思考。