放射性皮肤溃疡(radiation ulcer)为常见的皮肤放射损伤,主要见于恶性肿瘤的放射治疗、战时核辐射、意外事故受照射等。由于创面坏死以及组织液丢失导致营养不良以及感染,致残率及死亡率逐年升高。虽然近年来高压氧疗、VSD负压封闭吸引等技术被广泛应用于慢性难治性创面的治疗,但是对于具有潜在性、进展性等特点的慢性放射性皮肤溃疡的治疗效果却并不理想。迄今为止,放射性皮肤溃疡形成及难以愈合的机制仍未被阐明。因此,探讨放射性溃疡难愈合机制以及寻找一种更加安全有效的治疗方法已成为当务之急。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,简称MSC)具备归巢、分化、旁分泌等生物学特性。据报道,MSCs能够修复重建放射性皮肤损伤、糖尿病、动脉闭塞性脉管炎和褥疮等疾病引起的难治性创面。脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)由分娩后的废弃脐带中分离培养获得,它具有来源及取材方便,免疫原性低等特点,有可能成为修复慢性难治性皮肤溃疡的主要种子细胞。基于iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术的蛋白质组学研究,有利于探索疾病的发生机制。iTRAQ技术结合液相色谱质谱联用(LC-MS/MS),能够展示蛋白质全貌以及表达量的变化,已经成为筛选差异蛋白质的有效工具。然而目前,学者们对应用iTRAQ技术探讨放射性皮肤溃疡发病机制以及间充质干细胞修复慢性难治性溃疡创面的机制研究尚未引起重视。本研究首先利用机械法从脐带华尔通胶中获得贴壁生长的hUCMSCs,并经培养、传代,扩增、鉴定,为下一步实验提供种子细胞。其次建立放射性皮肤溃疡动物模型,将hUCMSCs应用于皮肤溃疡创面,观察其归巢能力及治疗效果。第三,应用iTRAQ-LC-MS/MS技术,寻找放射性皮肤溃疡组织与正常皮肤之间以及与hUCMSCs治疗组之间的差异蛋白。第四,对蛋白质组学筛选的差异蛋白进行蛋白免疫印迹(Western blot)或免疫组化验证,探讨放射性溃疡形成及难愈合机制,以及寻找hUCMSCs移植修复慢性难治性创面的机制。体内研究结果发现:利用机械法可以从脐带华尔通胶中获得贴壁生长的hUCMSCs,通过传代、培养和增殖能够满足后续实验的需要。hUCMSCs可以在放射性皮肤溃疡组织中顺利归巢、增殖并加速创面愈合以及改善皮肤修复质量;基于iTRAQ技术的蛋白质组学研究结果表明差异蛋白主要有角蛋白以及与细胞凋亡和细胞增殖相关的蛋白。部分差异蛋白应用Western blot或免疫组化得以进一步验证。KEGG通路富集分析表明P53细胞信号通路、PI3K-Akt细胞信号通路、MAPK细胞信号通路以及Wnt等细胞信号通路可能参与了脐带间充质干细胞修复放射性皮肤溃疡的活动,这可能与hUCMSCs通过旁分泌效应促进放射性皮肤溃疡组织表皮干细胞增殖,抑制其凋亡有关。上述研究结果为间充质干细胞修复慢性难治性创面提供了新的思路和方法。本实验研究分为四部分,研究目的、方法、结果及结论分述如下。第一部分人脐带间充质干细胞提取、鉴定及生物学特性的检测目的:探讨一套完整可行的人脐带间充质干细胞制备方法,为后续实验奠定基础。方法:取新生儿脐带,提取华尔通胶,机械法消化,组织块贴壁法分离培养,传代扩增。选取第1~8代细胞行流式细胞术检测细胞的表面标志物。结果:经贴壁培养,可获得大量hUCMSCs。细胞呈长梭形或多角形、旋涡状或流线样分布。传至第8代以后,细胞仍生长活跃,增殖能力强。流式细胞检测,培养至第3~8代以后,细胞均强表达间充质干细胞表面特异性标记CD90、CD44、CD105、CD73,而不表达或低表达造血系细胞标记CD34,CD43,CD19,CD11b及主要组织相容性抗原HLA-DR,符合MSCs的生物学特征。结论:利用机械法可从脐带华尔通胶获得贴壁生长的hUCMSCs,并经培养、传代,可纯化、扩增得到大量满足后续实验需要的hUCMSCs。第二部分脐带间充质干细胞修复大鼠放射性皮肤溃疡的实验研究目的探讨移植hUCMSCs对于电子线照射引起的大鼠放射性皮肤溃疡的治疗效果。方法将60只SD大鼠采用随机数字表法平均分为3组,假伤组、放射性皮肤溃疡组、脐带间充质干细胞治疗组。以直线加速器产生的4 Mev电子线照射大鼠臀部皮肤,总剂量为45 Gy,制作放射性皮肤溃疡动物模型,脐带间充质干细胞移植后3d.7d.14d观察干细胞归巢及增殖情况;移植后1 w.2 w.3 w.4 w观察并比较3组创面愈合率;HE染色及Masson染色观察创面皮肤组织病理改变。结果:脐带间充质干细胞移植后3d.7d.14d创面组织中应用荧光显微镜观察到GFP标记的干细胞并获得增殖;干细胞移植后1 w.2 w.3 w.4 w,h CUMSCs治疗组创面愈合率高于放射性皮肤溃疡组,P?0.05,差异有统计学意义;病理观察发现,hUCMSCs治疗组与放射性皮肤溃疡组相比,有更多的再上皮化、胶原纤维增生以及汗腺皮脂腺等皮肤附件增生。结论脐带间充质干细胞可以在放射性皮肤溃疡组织中顺利归巢、增殖并加速创面愈合以及改善皮肤修复质量。第三部分基于iTRAQ技术的脐带间充质干细胞修复放射性皮肤溃疡的蛋白质组学研究目的:采用蛋白质组学方法寻找脐带间充质干细胞对电子线照射引起的大鼠放射性皮肤溃疡组织修复作用的差异蛋白,以及寻找参与修复活动的细胞信号通路。方法:液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)结合iTRAQ技术,将假伤组、放射性皮肤溃疡组、脐带间充质干细胞治疗组分别标记为114、115、116。样品混合后进行质谱鉴定,符合表达差异倍数大于1.2倍(上下调)且P-value小于0.05筛选标准的蛋白质视为差异表达蛋白质。结果:放射性皮肤溃疡组与假伤组相比,共筛选出540个差异蛋白,其中上调233个,下调307个;脐带间充质干细胞治疗组与放射性皮肤溃疡组相比,共筛选出568个差异蛋白,其中上调339个,下调229个;差异蛋白主要有角蛋白以及与细胞凋亡和细胞增殖相关的蛋白。差异表达蛋白质KEGG通路富集分析表明P53细胞信号通路、PI3K-Akt细胞信号通路、MAPK细胞信号通路以及Wnt等细胞信号通路参与了脐带间充质干细胞修复放射性皮肤溃疡的活动之中。结论:本研究表明iTRAQ-LC-MS/MS技术能够快速、有效地进行差异蛋白质筛选,为探讨h CUMSCs移植修复慢性难治性创面的修复机制奠定基础。第四部分脐带间充质干细胞修复放射性皮肤溃疡机制探讨目的:对蛋白质组学筛选的差异蛋白进行Western blot或免疫组化验证,阐述hUCMSCs移植修复慢性难治性创面的修复机制。方法:应用免疫组化方法检测角蛋白19的表达情况;应用Western blot方法检测caspase 3蛋白表达以及TUNEL染色,观察创面组织细胞凋亡变化情况;应用Western blot方法检测PCNA蛋白表达,观察创面组织细胞增殖变化情况。结果:角蛋白19在放射性皮肤溃疡组织中表达减少,在hUCMSCs移植修复后1w及4w表达增加,P?0.05,差异有统计学意义;TUNEL染色以及Western blot方法检测caspase 3表明电子线照射引起创面组织细胞凋亡增加,hUCMSCs移植修复可以减少创面组织细胞凋亡;应用Western blot方法检测PCNA发现电子线照射抑制创面组织细胞增殖,hUCMSCs移植修复可以增加细胞增殖。结论:hUCMSCs通过旁分泌效应促进表皮干细胞生长增殖,抑制其凋亡可能是hUCMSCs移植修复慢性难治性创面的修复机制。