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目的：因创伤、疾病导致的器官或组织缺损的修复一直是临床亟待解决的难题。近年来的研究主要致力于发展能够代替自体骨移植物的人工合成材料以修复这些缺损的器官或组织。由于与骨的无机成分相似,很长一段时间以来,磷酸钙(calcium phosphate, CaP)陶瓷一直是被广泛应用的人工合成的骨替代材料,但其机械强度及骨再生能力仍无法与自然再生骨相比。在保留其人工合成的特性下,很多措施被应用于改善CaP陶瓷的生物活性,常用的如改变材料的化学组成、控制材料的表面形貌等。但CaP陶瓷是相对复杂的生物材料,其理化性能交织缠绕在一起,这使得在不改变陶瓷的其它特性的前提下单独改变其某一特性变得非常困难。造成的结果是,很难将某一类型的生物反应与材料的某一个或某几个特性关联在一起,而这对于设计与自体骨移植物功能相当的新型骨移植替代物来说是至关重要的。为了改善目前存在的人工合成的骨移植替代物,有必要深入理解其某一性能对生物反应的影响,进而寻找出恰当的方法将我们期望的性能合并在一起以获得新的、改良的功能性生物材料。为此,我们研制出了具有可控的微米级表面形貌的聚乳酸／纳米羟基磷灰石复合物(poly (lactic acid)/hydroxyapatite, PLA/nHA)。并探讨其对与临床密切相关的骨髓来源的人间充质干细胞(human mesenchymal stromal cells, hMSCs)增殖及骨向分化的独立影响。聚乳酸的分子量大小及CaP陶瓷使用与否影响材料的化学组成,而通过软刻技术可获得具有凹型或相同微尺寸的乳头状的表面微结构。方法：制备两种PLA/HA复合物,分别为低分子量的PLA/HA (L-PLA/HA)和高分子量的PLA/HA (H-PLA/HA),以相应分子量的PLA为对照。利用脉冲飞秒激光微加工技术制造出含有本研究所用到的凹形结构的不锈钢模型,翻制出其阴模(乳头)并再次复制出相应的凹形结构,再通过软刻技术将凹形结构及相应的乳头状结构等两种微形貌转移印制到PLA/HA复合物及PLA表面,以平面PLA/HA复合物及PLA为对照。然后将扩增得到的第三代hMSCs培养在具有不同微形貌的材料表面。用于观察分析细胞形态的样本,每孔接种4000个细胞,以基础培养基(basic medium, BM)培养,3天后,采用扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)和荧光显微镜观察细胞形态,并采用CellProfiler软件对细胞形态参数如细胞面积、周长、短轴长度等进行分析。用于评价细胞增殖、骨向分化、基因表达、Ca2+与Pi浓度及材料表面变化的样本,每孔接种10,000个hMSCs,分别以BM和骨向诱导培养基(osteogenic medium, OM)培养。分别在细胞培养的第3、7、14天,通过DNA测定,评价PLA/HA的化学组成及表面微结构对hMSCs增殖的影响。在第7、14天,通过ALP测定,评价PLA/HA的化学组成及表面微结构对hMSCs骨向分化的影响。为评价材料表面形貌和化学组成对骨向分化标志物在mRNA水平的影响,分别在细胞培养的第7、14天,提取细胞总RNA,经逆转录成cDNA后,实时定量PCR(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测骨相关基因如骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2) Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin, OP)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)及Ⅰ-型胶原(collagen type 1,Col-1)的表达。在细胞培养的第3、7和14天,通过测定培养基中Ca2+和Pi浓度的变化,分析Ca2+和Pi在hMSCs骨向分化中的作用。在细胞培养的第14天,SEM及能量弥散X射线谱(energy dispersive X-ray spectroscopy, EDS)观察样本表面形貌的改变。结果：(1)所有的材料表面均成功被凹或乳头状微结构形貌化。钙磷元素映射图表明陶瓷相在两种复合物中都呈均匀分布。(2)细胞形态同时受HA的存在及表面微结构的影响,但后者的影响更显著。(3)化学组成,更确切地说是磷酸钙的存在,对细胞的增殖起积极作用,而表面形貌的影响可以忽略不计。在OM中,细胞增殖趋势与在BM中类似。(4)与高分子量的PLA/HA复合物及两种单纯的PLA聚合物相比,基于低分子量PLA的复合物显著促进hMSCs的骨向分化,尤其是BMP-2与OP mRNA的表达。而凹形表面形貌进一步促进培养在低分子量PLA/HA复合物上的hMSCs的OP表达。地塞米松的加入强烈抑制了BMP-2和OP mRNA在第7天和第14天的表达,而显著增强了ALP在这两个时间点的表达。与使用BM相比,材料本身性能,尤其是化学组成对hMSCs骨相关基因表达的影响显著性降低。总的来说,在本实验条件下,尽管在某些情况下,化学因素和表面微结构产生协同效应,但化学因素的独立效应,尤其是磷酸钙的存在,显著强于表面微结构的独立效应。(5)离子浓度分析提示含有L-PLA/HA复合物的培养基(BM或OM),无论L-PLA/HA表面是哪种形貌,其Ca2+、Pi浓度均显著低于其他三种材料的培养基。(6)经过14天的细胞培养,无论是平面表面还是形貌化的表面,L-PLA/HA样本表面均生成了大量广泛的微孔,而H-PLA/HA表面没有观察到微孔。14天后,两种复合物中P/C及Ca/C的比率均增大,但Ca/P比率保持不变。结论：联合基于不同分子量的PLA的PLA/HA复合物与软刻技术是研究区分化学组成和表面微结构对hMSCs行为影响的独立效应的有效方法。表面微结构主要影响细胞的附着和形态,而化学组成,如磷酸钙的存在,主要影响细胞的增殖及骨向分化,尤其是钙离子敏感型基因的表达。本课题所使用的方法为深入研究生物材料与生物环境的相互作用开辟了新的途径,可作为研发具有改良生物活性的生物材料的起点。