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[目 的]胃癌患者转移的主要途径是淋巴系统,淋巴结受累程度影响着患者的生存率。肿瘤细胞的增殖活性及肿瘤新生血管的形成对于实体肿瘤的生长起着关键性作用。许多研究表明,在预测肿瘤的进展方面,淋巴管形成是比血管形成更可靠的一个参数。然而,胃肿瘤细胞是如何通过潜在淋巴管转移及肿瘤相关的淋巴管形成在淋巴结转移进展中的生物作用仍然不清楚。本研究采用病理免疫组化、Griess试剂法、ELSA、Western blot等技术进行BH4/iNOS与胃腺癌组织中D2-40表达关系的研究、以及BH4/iNOS与胃腺癌组织中淋巴管密度(LVD)关系的研究。探索BH4/iNOS在胃腺癌组织中淋巴管生成的作用,并通过动物实验来阐明其作用机制,对揭示胃腺癌淋巴管生成分子机制有重要意义,可望为胃腺癌抗淋巴管生成治疗提供新的靶点,以提高晚期胃腺癌治疗效果。[方法]1、临床上收集40例来自胃腺癌患者的癌组织及癌旁组织标本,并收集其相关临床资料。2、通过免疫组化实验对人胃腺癌组织及癌旁组织中iNOS和D2-40蛋白表达情况进行探究。用D2-40单克隆抗体标记淋巴管内皮细胞,检测人胃腺癌组织及癌旁组织中淋巴管密度(LVD)。3、利用卡方检验统计学方法对人胃腺癌组织及癌旁组织中iNOS和D2-40蛋白阳性表达率进行分析,利用Spearman统计学方法进行iNOS和D2-40蛋白在人胃腺癌组织中表达相关性分析。4、通过无菌细胞培养方法先培养足够数量的MKN-45人胃癌细胞,利用BALB/c-nu小鼠建立稳定可靠的人胃癌细胞株MKN-45小鼠荷瘤模型。用随机数字表法将其分为2组,实验组(BH4组)给予BH4腹腔注射处理,对照组(Saline组)给予等量生理盐水处理。5、用免疫组化方法检测BH4组及Saline组中iNOS和D2-40蛋白的表达情况。D2-40是淋巴管内皮细胞特异性标记抗体,用于检测BH4组和Saline组中淋巴管密度(LVD)。6、用ELSA法(酶联免疫吸附测定)检测BH4组和Saline组肿瘤组织中BH4的水平,通过两独立样本t检验对BH4组和Saline组肿瘤组织中BH4水平进行统计学分析。7、用Griess试剂法(硝酸还原酶法)检测BH4组和Saline组肿瘤组织中NO的水平,通过两独立样本t检验对BH4组和Saline组肿瘤组织中NO水平进行统计学分析。8、用Western blot法检测BH4组和Saline组肿瘤组织中iNOS蛋白表达情况,通过Image-Pro Plus分析目的蛋白灰度值,与内参蛋白相比较,计算出两组中目的蛋白的相对表达量并进行比较。[结 果]1、通过免疫组化实验,检测结果显示人胃腺癌癌组织中iNOS和D2-40蛋白的阳性表达率明显高于癌旁组织中的阳性表达率,差异有统计学意义(P<0.05)。2、统计分析结果显示,人胃腺癌组织中iNOS和D2-40蛋白的表达水平与肿瘤浸润深度呈正相关,与淋巴结转移数目呈正相关(P<0.05),与性别及年龄构成无关(P>0.05)。3、相关性分析结果显示,人胃腺癌组织中iNOS和D2-40蛋白的表达呈显著正相关(P<0.05)。4、动物试验免疫组化检测显示BH4组癌组织中iNOS和D2-40的阳性表达率明显高于Saline组的阳性表达率,差异有统计学意义(P<0.05)。5、ELISA法(酶联免疫吸附测定)检测显示BH4组癌组织中BH4水平明显高于Saline组,差异有统计学意义(P<0.05)。6、Griess试剂法(硝酸还原酶法)检测显示BH4组癌组织中NO水平明显高于Saline组,差异有统计学意义(P<0.05)。7、Western blot法检测显示BH4组癌组织中iNOS表达水平明显高于Saline组,差异有统计学意义(P<0.05)。[结 论]BH4/iNOS可促进胃腺癌淋巴管生成,其机制与BH4与iNOS偶联,诱导肿瘤局部高水平NO的产生有关,研究结果有望为胃腺癌淋巴管生成抑制提供新的可能依据。