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目的:凋亡是急性心梗中心肌细胞的损伤形式之一,可能导致梗死面积的扩大和继发性心室重塑。信号素3A(Sema3A)是信号素家族(Semaphorins)的重要成员之一,其功能复杂涉及神经排斥,细胞迁移,分化以及诱导凋亡等诸多方面。在这一实验中,我们检测了原代培养的心肌细胞中是否含有Sema3A,以及缺氧损伤后的心肌细胞Sema3A表达的改变,并通过慢病毒转染改变心肌细胞Sema3A表达,研究了其对原代培养的心肌细胞凋亡的影响。
方法:使用原代培养乳鼠心肌细胞,分别进行30min,2h,5h,12h,24h缺氧(1% O2)处理,通过实时荧光定量 PCR(Real time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western Blot)两种方式,检测不同时间缺氧损伤对细胞Sema3A的表达的影响。设计构建能够用于心肌细胞的过表达和抑制Sema3A表达的慢病毒,并通过实时荧光定量 PCR(Real time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western Blot)对慢病毒效果进行检测。细胞分为对照组,空病毒组(只携带GFP),过表达/抑制病毒组(既携带GFP,又携带目的基因)。过表达Sema3A病毒转染后,蛋白免疫印迹法检测Cleaved caspase-3表达,缺口末端标记法(Tunel)检测凋亡率。抑制Sema3A病毒转染后,经过两小时的缺氧处理,Western Blot检测Cleaved caspase-3表达,Tunel检测凋亡率。
结果:①原代培养的乳鼠心肌细胞中含有Sema3A。发现不论是Mrna还是蛋白水平,随着缺氧时间延长(0h/0.5h/2h/5h/12h/24h),原代培养的乳鼠心肌细胞的Sema3A表达逐渐下降(Mrna: 1.0vs0.900±0.273 vs0.721±0.128 vs0.497±0.112 vs0.072±0.024 vs0.058±0.020, 0.5h/2h P>0.05, 5h/12h/24h P<0.05;蛋白:0.451±0.130 vs0.450±0.101 vs0.444±0.106 vs0.355±0.087 vs0.260±0.068 vs0.205±0.075,0.5h/2h/5h P>0.05,12h/24h P<0.05)。②构建的慢病毒能够从Mrna和蛋白水平有效改变原代培养的心肌细胞Sema3A的表达(Mrna水平:过表达病毒转染后,相对于对照组:空病毒组0.752±0.135,P>0.05;过表达病毒组:33.670±3.840,P<0.01;抑制病毒转染后,相对于对照组:空病毒组0.892±0.125,P>0.05;抑制病毒组:0.179±0.052,P<0.05),(蛋白水平:过表达病毒转染后:对照组0.484±0.060;空病毒组:0.589±0.072,P>0.05(相对于对照组);过表达病毒组:1.003±0.130,P<0.05(相对于对照组);抑制病毒转染后:对照组0.895±0.084;空病毒组:0.723±0.072,P>0.05(相对于对照组);抑制病毒组:0.373±0.032,P<0.05(相对于对照组))。③通过增加细胞Sema3A表达,Cleaved caspase-3表达上调(对照组:0.542±0.102;空病毒组:0.650±0.098;过表达病毒组:1.674±0.246,P<0.05),细胞凋亡率显著增加(对照组:0.672%±0.055%;空病毒组:0.854%±0.164%;过表达病毒组:23.458%±8.656%,P<0.05)。抑制心肌细胞Sema3A的表达后进行缺氧2小时处理,Cleaved caspase-3表达下调(对照组:1.453±234;空病毒:1.567±0.431;Sema3A病毒:0.752±0.112,P<0.05),细胞凋亡率下降(对照组:15.892%±1.342%;空病毒:17.620%±1.587%;Sema3A病毒:5.478%±0.958%,P<0.05)。
结论:我们的结果提示原代培养的乳鼠心肌细胞能够表达Sema3A,在受到缺氧损伤后,心肌细胞中Sema3A表达逐渐下调。我们在试验中增加Sema3A表达,心肌细胞凋亡率增加,减少Sema3A表达,能够降低缺氧导致的凋亡损伤。我们的结果提示心肌细胞缺氧损伤后,可能通过下调Sema3A表达减少凋亡。