研究背景:乳腺癌作为女性恶性肿瘤中最常见的也是最具威胁力的恶性肿瘤,统计分析数据显示其全球发病率仅次于第一位的肺癌。随着研究的深入,其治疗方式越来越趋于多样化,常见的有手术治疗、放疔、化疗、内分泌治疗、中医针灸等。然而临床上仍然有1/3的女性经过治疗后发生复发和转移。研究人员指出,许多涉及调控肿瘤发生发展转归的基因与蛋白都参与了对肿瘤干细胞调控。其中,miR-34a是与乳腺癌密切相关的小分子RNA之一,它在乳腺癌的增殖、侵袭、转移及凋亡等过程中均发挥了重要作用。MicroRNA-34a作为抑癌基因p53下游靶基因,它介导的细胞凋亡在肿瘤干细胞的自我更新中可能发挥重要作用,只有杀灭乳腺癌干细胞才能进一步改善乳腺癌患者的预后。DLL1(Delta-like 1)蛋白作为Notch信号转导通路中Notch1受体的配体,是单次跨膜糖蛋白,属于DSL(Delta,Serrate,Lag-2)蛋白。Notch信号转导途径的活化最早始于Notch配体结合到Notch受体,二者结合后经过一系列生化反应活化Notch信号转导通路,各种不同组织及其细胞的正常的或异常的生长发育分化活动都要受到该通路的调控。另有研究指出DLLl参与调控肿瘤的增殖、分化、凋亡、转移、复发等过程。Notch信号转导通路作用非常广泛,它不仅对胚胎及正常组织的生长发育至关重要,还是肿瘤干细胞中必不可少的信号转导通路之一。新近研究表明:Notch信号的表达增强增加了肿瘤细胞的增殖能力,活化Notch信号可以起到维持肿瘤干细胞,诱导上皮间质转化等作用。Notch信号转导通路的下游靶基因在该通路生物学特性的实现过程中扮演着重要角色,其中已知的靶基因包括:hey、cyclind1、hes、nrarp、p21、pre-tα、nf-κb等。目的:探讨mir-34a对dll1蛋白的调控作用,以及mir-34a/dll1与notch信号通路和乳腺癌干细胞的作用,为乳腺癌的诊断和治疗提供重要的理论和实验依据。方法:1将乳腺癌细胞株mcf-7作为主要研究对象,采用免疫磁珠分选技术分选cd44+/cd24-乳腺癌干细胞,qrt-pcr,westernblot技术检测分选出的干细胞中mir-34a和dll1蛋白表达趋势。2.转染mir-34a类似物和阻滞剂调节dll1蛋白在mcf-7细胞株中的表达情况。qrt-pcr和westernblot技术分别检测mcf-7细胞内dll1mrna和dll1蛋白的表达趋势,westernblot进一步探索notch信号转导通路下游靶基因hey1蛋白的表达、乳腺癌干细胞重要标记物aldh1表达以及凋亡相关的caspase3蛋白的表达情况,探讨mir-34a/dll1蛋白对肿瘤及干细胞凋亡的影响及其机制。3.小rna分子干扰技术构造dll1基因沉默的乳腺癌细胞系模型,通过qrt-pcr和westernblot技术相继检测转染后的沉默效率,确定dll1基因被成功下调,westernblot技术检测hey1,caspase3及aldh1蛋白的表达,进一步证明mir-34a通过调控dll1蛋白实现其对notch信号转导通路及乳腺癌干细胞的调控。4.最后采用cck-8实验和hochest33342染色验证mir-34a/dll1对乳腺癌细胞的增殖和凋亡的影响。结果:1.分选cd44+/cd24-乳腺癌干细胞后,检测发现乳腺癌干细胞中的mir-34a趋于低表达状态,而dll1蛋白则趋于高表达。2.通过转染实验过表达/抑制mir-34a后,westernblot,qrt-pcr分别检测dll1蛋白表达水以及基因表达水平;westernblot检测hey1,caspase3,aldh1蛋白表达,结果显示过表达mir-34a从转录水平抑制了dll1蛋白表达,hey1蛋白、aldh1与dll1蛋白表达水平正相关,而caspase3表达水平与dll1蛋白负相关。3.小rna干扰技术敲低dll1基因表达后,westernblot方法检测hey1,Caspase3,ALDH1蛋白表达与miR-34a mimics转染后的表达水平一致。4.CCK-8法检测DLL1蛋白对乳腺癌细胞增殖的影响结果显示:与对照组相比,下调DLL1蛋白抑制了MCF-7细胞增殖,上调DLL1蛋白对细胞增殖有促进作用。Hochest33342染色结果表明下调DLL1蛋白后凋亡的细胞数增多。下调DLL1蛋白对细胞增殖的抑制作用可能是由于其诱导凋亡作用减少所致。结论:1.MiR-34a可通过下调DLL1蛋白表达促进乳腺癌细胞凋亡。2.Dll1蛋白通过作用于Notch信号转导通路,对乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞的凋亡进行调控。