论文部分内容阅读
细胞凋亡是调控机体发育和维护内环境稳定的重要机制。本文以我国特有实验鱼类稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)为研究材料,通过短期半静态换水式暴露实验(28d),研究了BaP引起的稀有鮈鲫肝、肠和鳃的组织病理学变化情况；初步探讨了在活体实验中,BaP对稀有鮈鲫细胞凋亡的影响；采用Real-time PCR定量方法,探讨了BaP对稀有鮈鲫肝脏组织中细胞凋亡线粒体途径关键基因的调控作用。主要研究成果归纳如下：1稀有鮈鲫细胞凋亡线粒体途径关键基因的克隆及序列分析从稀有鮈鲫肝脏组织中同源克隆了bcl-2、apaf-1、caspase-3和caspase-9基因的部分cDNA片段,并进行了序列分析。结果表明,caspase-3和caspase-9基因片段与唐鱼(Tanichthys albonubes)相对应的核苷酸序列同源性最高,bcl-2、apaf-1基因片段分别与鮈鱼(Gobio gobio)、鲤鱼(Cyprinus carpio)相对应的核苷酸序列同源性最高。基于稀有购鲫和已知物种的caspase-3基因核苷酸序列构建了系统发育树,结果表明稀有鮈鲫与唐鱼、斑马鱼(Brachydanio rerio)的亲缘关系最近,而与金头鲷(Sparus aurata)、红鳍东方鲀(Fugu rubripes)的亲缘关系较远。2BaP引起稀有鮈鲫的组织病理学变化采用HE染色法(Hematoxylin-eosin staining)检测了稀有鮈鲫肝、肠和鳃的组织病理学变化。结果表明,不同浓度的BaP可导致稀有鮈鲫肝、肠和鳃出现不同程度的组织病理学变化,主要表现为：肝细胞体积增大、排列疏松、细胞核固缩、碎裂等；肠粘膜层杯状细胞明显增多并出现大量空泡细胞,部分纹状缘脱落等；鳃丝上皮细胞增生,鳃小片融合等。3BaP对稀有鮈鲫细胞凋亡的影响采用TUNEL法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)进行细胞凋亡原位检测,研究了不同浓度(1.0gg/L、5.0μg/L、20.0μg/L、80.0gg/L)的BaP对稀有鮈鲫细胞凋亡的影响。TUNEL凋亡原位检测结果表明,BaP可引起稀有鮈鲫肝脏细胞出现明显的凋亡现象,而对肠和鳃组织中细胞凋亡没有明显影响。肝脏细胞凋亡率与浓度之间呈明显的剂量-效应关系,低浓度(1.0μg/L、5.0μg/L)处理组与对照组相比没有显著性差异(p>0.05),高浓度(20μg/L、80μg/L)处理组细胞凋亡率明显增加,与对照组相比,差异显著(p<0.05)。4BaP对细胞凋亡线粒体通路关键基因的调控作用采用Real-time PCR方法检测cyp1a1、p53、bcl-2、bax、apaf-1、caspase-9和caspase-3基因在稀有鮈鲫肝脏中的表达情况。结果表明,cyp1a1、p53、bax和caspase-9基因的表达量随着药物浓度的升高明显增加,低浓度组(1.0μg/L)与对照组相比没有显著性差异(p>0.05),高浓度组(5.0μg/L、20.0μg/L、80.0μg/L)与对照组相比差异显著(p<0.05),基因表达量与药物浓度之间呈现明显的剂量-效应关系。Bcl-2基因表达量在1.0μg/L、20.0μg/L、80.0μg/L浓度组没有明显变化,而5.0μg/L浓度组基因表达量明显增加,是对照组的2.07倍(p<0.05)；Apaf-1基因的表达量表现为受到了BaP的抑制,各浓度组与对照组相比差异显著(p<0.05)；Caspase-3基因表达量与药物浓度之间没有明显的效应关系,各浓度组与对照组相比没有显著性差异(p>0.05)。线粒体通路关键基因的表达情况表明可能多种机制参与了BaP对稀有购鲫肝脏细胞凋亡的诱导,并非唯一的capase依赖性通路,BaP诱导稀有鮈鲫肝脏细胞凋亡过程中导致了线粒体功能的紊乱,包括激活cyp1a1、p53、bcl-2、bax和caspase-9基因,而抑制了apaf-1基因的表达。