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兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒（rabbit hemorrhagicdisease virus，RHDV）引起的兔的一种疾病。该病具有高度传染，高发病率、高致死性的特点。成年兔染病后以全身实质器官水肿、淤血及出血性变化为主要特征，其发病率和致死率都很高，是兔的一种毁灭性传染病。兔出血症病毒（RHDV）属于杯状病毒科（Caliciviridae），兔病毒属（Lagovirus）。RHDV基因组为单股正链RNA，全长7437bp，基因组含两个开放阅读框(open reading frame,ORF)，即ORF1和ORF2，ORF1编码一个含有2344个氨基酸残基的多聚蛋白(257kD)，C末端包含衣壳蛋白VP60；ORF2位于基因组的3’端，编码一个小衣壳蛋白VP10。VP60蛋白的分子质量约为60kD，故称为VP60，是RHDV的主要结构蛋白，它在诱导抗病毒感染的免疫反应中起重要作用，是病毒免疫保护性抗原。目前使用的RHDV疫苗是用染病兔子肝脏提取物作为组织灭活苗，或者用原核表达的重组VP60蛋白作为抗原免疫兔子，以预防兔出血症疾病。这些方式虽然具有良好的免疫效果，但也有自身所不可避免的种种缺点。近些年，随着植物基因工程技术的发展，通过转基因植物生产疫苗成为现实。所以，当前RHDV疫苗的研究主要采用植物基因工程技术进行疫苗的研制。本研究在克隆了RHDVVP60基因的基础上对VP60的原核表达抗体制备进行研究，利用农杆菌转化法将VP60基因进行转化烟草和百脉根，同时对苜蓿再生体系的建立进行了探索，取得以下结果：1.构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体，进行原核表达并制备其蛋白抗体。以实验室获得并保存VP60基因的质粒(pGEM-Teasy-vp60)为模版，采用PCR方法获得VP60基因，将其克隆到pET28a(+)载体上，构建重组表达载体pET28a(+)-vp60，酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，用0.4mmol/LIPTG在20℃的条件下诱导8h，VP60蛋白得到了高效表达，利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白，注射兔子后制备了抗VP60多克隆抗体，制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。为进一步研究VP60转基因奠定了基础。2.以烟草SR1叶片为外植体材料，用构建好的含有拟南芥atslA基因启动子的植物转化载体pCAMBIA1300-ats1A-vp60转入根癌农杆菌EHA105中，然后对烟草叶片进行根癌农杆菌介导的转化研究。结果表明，转化的外植体叶片在MS+6-BA3mg/L培养基上28℃共培养2d后，转入含有潮霉素21mg/L培养基上筛选，再生芽生根后，提取转化植株基因组DNA，进行PCR检测和Southernblot检测，有部分转化植株中整合了目的基因；进一步的提取转基因植株的RNA，反转录PCR结果表明，植株中含有整合的目的基因，Westernblot检测初步证实有微量的目的蛋白在烟草中表达。3.建立了百脉根的高频再生体系，百脉根在MS+6-BA0.2mg/L培养基上下胚轴再生率可达到100%，外植体下胚轴再生率明显比子叶的再生率高，根再生的最优培养基为MS+6-BA0.2mg/L；构建了pCAMBIA1301-vp60基因植物表达载体，确立了百脉根最适潮霉素筛选浓度为2.0mg/L，并利用根癌农杆菌EHA105（含pCAMBIA1301-vp60）介导对百脉根的下胚轴进行遗传转化。转化后经过潮霉素筛选，再生芽转入根再生培养基（含潮霉素）上得到转化植株，提取转化植株的基因组DNA及RNA，基因组PCR检测和反转录PCR检测的结果表明部分的转化植株含有目的基因VP60。4.对苜蓿金皇后的外植体下胚轴进行了再生体系的研究，最佳的消毒条件是75%酒精消毒1min，0.1%升汞消毒5min；对不同的激素配比下分别进行愈伤组织诱导的筛选，确定最佳的培养基为MS+NAA1.8mg/L+6-BA1.6mg/L；利用不同的激素诱导愈伤组织分化，最佳的诱导培养基配比为MS+NAA0.3mg/L+6-BA0.6mg/L。用诱导分化幼苗下胚轴进行潮霉素筛选，不同浓度的潮霉素对紫花苜蓿诱导愈伤结果表明，各浓度对愈伤组织的分化均有一定的抑制作用，且随浓度升高，抑制作用增强，确定最适的选择压力浓度为15mg/L。为下一步VP60基因转化苜蓿创制新型牧草奠定了基础。