[目的]构建能够表达虎源H5N1亚型流感病毒NP蛋白的重组犬2型腺病毒,为哺乳动物尤其是虎H5N1亚型禽流感病毒重组活载体疫苗的研究奠定理论基础和技术支持。[方法]应用DNA重组技术,构建能够表达禽流感病毒NP基因的真核表达载体pVAX-NP;采用间接免疫荧光和间接ELISA方法检测其在哺乳动物细胞BHK-21细胞中的表达情况;将pVAX-NP中含有NP表达盒的片段定向克隆入犬2型腺病毒载体pPoly2-CAV2的E3区,获得在E3区缺失处插入NP表达盒的重组质粒pCAV-2-NP。利用脂质体介导法,将重组质粒pCAV-2-NP导入哺乳动物细胞DK细胞中;观察细胞变化,待产生典型的腺病毒样细胞病变时,采用电镜进行重组病毒的形态学观察,利用血凝实验鉴定重组病毒的血凝特性,应用PCR以及RT-PCR方法检测重组病毒在繁殖的过程中NP表达盒片段是否进行缺失以及能否转录NP基因的mRNA,采用间接免疫荧光和的间接ELASA的方法检测NP基因在哺乳动物细胞DK中的表达情况,应用病毒常规传代培养检测重组病毒体外遗传稳定性。[结果]真核表达载体pVAX-NP能在哺乳动物细胞中正确的表达NP蛋白以及表达NP蛋白具备其应有的生物活性,CAV-2-NP重组病毒具有典型的CAV-2形态特征和血凝特性,其在繁殖的过程中NP表达盒片段没有缺失,并且能够转录NP基因的mRNA,ELISA和免疫荧光分析表明重组表达产物可被禽流感病毒NP单克隆抗体所识别,在体外具有良好的遗传稳定性。[结论]本实验成功构建了并获得了表达虎源H5N1亚型禽流感病毒NP蛋白重组犬2型腺病毒。