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研究目的:1、本研究首先筛选分析与弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma,DLBCL）密切相关的趋化因子/趋化因子受体,并深入研究所得结果——CCR6及其靶向的miRNA在DLBCL中的表达情况与生物学功能,以期为DLBCL的研究提供新的方向。2、本文从转录和转录后调控两方面探讨DLBCL中CCR6表达变化的可能表观遗传调控机制,为明确DLBCL的发生机制及表观遗传治疗联合应用于DLBCL提供理论依据。3、本研究初步探讨CCR6对DLBCL免疫微环境的影响,并通过生物信息学配合生物学实验方法筛选构建了靶向性全硫代寡聚脱氧核苷酸链（Oligodeoxynucleotide,ODN）,以期作为DLBCL免疫佐剂,为DLBCL治疗提供新的思路和途径。研究方法:1、系统检索分析公共数据库所收录的DLBCL表达谱芯片数据集,利用生物信息学方法筛选DLBCL相关的趋化因子/趋化因子受体;从蛋白水平和mRNA表达情况两方面验证所得结果——CCR6在DLBCL组织和细胞株中的表达水平;分析临床标本中CCR6表达水平与临床信息的相关性。2、运用生物信息学方法预测靶向CCR6的miRNA,双荧光素酶报告基因实验进行验证;实时荧光定量PCR（Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测所得结果在DLBCL组织和细胞株中的表达水平,并进行临床相关性分析;慢病毒转染SU-DHL-2和SU-DHL-6细胞,观察CCR6及其相关miRNA的表达水平变化。3、继续上调miR-518a-5p或下调CCR6表达水平,通过细胞增殖、周期、凋亡、迁移实验检测CCR6和miR-518a-5p对DLBCL细胞生物学功能的影响;向DLBCL细胞内共转染CCR6 siRNA和miR-518a-5p inhibitor,通过上述实验以期进一步验证miR-518a-5p从转录后水平调控CCR6的表达;为阐明miR-518a-5p/CCR6引起DLBCL生物学行为改变的机制,采用qRT-PCR、western blot方法检测CCR6沉默或miR-518a-5p过表达后下游JAK-STAT信号通路相关基因的表达变化。4、利用公共数据库预测DLBCL中CCR6表达变化的可能机制;收集不同浓度和不同时间的C646处理后的DLBCL细胞,qRT-PCR检测CCR6表达变化;染色质免疫共沉淀法检测CCR6启动子区域组蛋白H3赖氨酸27乙酰化（Histone H3 on lysine 27acetylation,H3K27ac）的情况。利用甲基化检测技术明确DLBCL中miR-518a-5p启动子区Cp G岛甲基化水平;收集不同浓度和不同时间的阿扎胞苷处理后的DLBCL细胞,qRT-PCR检测阿扎胞苷对CCR6和miR-518a-5p的表达影响。5、流式分析CCR6在DLBCL患者外周血Treg细胞与CD4+CD25-T细胞中平均荧光强度（Mean fluorescence intensity,MFI）;利用生物信息学方法筛选出人和小鼠CCR6-CCL20 mRNA的保守序列,并进行靶向CCR6-CCL20的ODN的设计、筛选、合成、鉴定和评估。研究结果:1、通过GEO和Array Express数据库相关数据集的系统筛选和分析,我们推测CCR6可能在DLBCL中发挥重要作用。qRT-PCR、western blot及免疫组化提示,CCR6在DLBCL组织和细胞株中的表达量明显升高。DLBCL组织中CCR6表达量与淋巴瘤国际预后指数及B症状存在相关性（p<0.05）。2、生物信息学预测并经双荧光素酶报告基因实验证实miR-518a-5p靶向调控CCR6。DLBCL组织中miR-518a-5p低表达,与CCR6负相关。敲低DLBCL细胞中CCR6基因引起miR-518a-5p表达水平升高;上调miR-518a-5p水平,CCR6表达受抑制。3、在SU-DHL-2和SU-DHL-6细胞中干扰CCR6和过表达miR-518a-5p均会抑制DLBCL细胞增殖、克隆形成和侵袭,加速DLBCL细胞凋亡。沉默CCR6还可阻滞细胞周期于G0/G1期。共转染CCR6 siRNA和miR-518a-5p inhibitor于DLBCL细胞后,与miRNA inhibitor control+CCR6 siRNA+组相比,DLBCL细胞增殖和迁移能力得到很大程度的恢复,DLBCL细胞凋亡率降低。进一步研究发现,干扰CCR6或过表达miR-518a-5p会引发下游JAK2和STAT6 mRNA、蛋白、磷酸化蛋白表达量下降。4、DLBCL中miR-518a-5p启动子区Cp G存在部分高甲基化。阿扎胞苷作用于SU-DHL-2和SU-DHL-6细胞引起miR-518a-5p表达水平升高,CCR6降低。生物信息分析发现H3K27ac富集也可能是DLBCL中CCR6异常表达的机制之一。将C646分别作用于SU-DHL-2和SU-DHL-6细胞,研究发现随着C646浓度增加,SU-DHL-2和SU-DHL-6细胞中CCR6表达量下降,启动子区域的H3K27ac富集程度降低。5、CCR6在外周血Treg细胞中的MFI明显强于CD4+CD25-T细胞。CCR6及其唯一的趋化因子配体CCL20均在DLBCL中表达升高。鉴于无法筛选CCR6 mRNA的保守序列,我们对CCL20 mRNA3’非翻译区进行保守序列的筛选,并合成靶向CCL20的全硫代ODN。本研究完成了对该ODN的鉴定与评估。研究结论:1、负性反馈回路miR-518a-5p-CCR6在DLBCL中发挥重要作用。2、DLBCL中CCR6表达量升高与miR-518a-5p高甲基化、CCR6启动子区域H3K27ac富集密切相关。3、表观调控分子调控基因表达进而磷酸化激活JAK2-STAT6信号通路促进了DLBCL的恶性生物学行为。4、CCR6可能在DLBCL免疫耐受中发挥关键作用。本研究构建的靶向性全硫代寡聚脱氧核苷酸链可能为DLBCL治疗提供新的思路和途径。