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目的1.检测lncRNA FAM99A在癌与癌旁组织的表达,评估FAM99A的临床意义;2.探索lncRNA FAM99A在肝癌中的生物学功能及上下游调控机制;3.基于转录组学测序数据与肝癌患者预后情况,探讨肝癌中存在的分子分型;并构建数学模型,用于肝癌患者治疗方式抉择、预后风险评估和疗效检测。方法1.通过转录组测序并结合生物信息学方法分析61对肝癌患者癌与癌旁组织中差异表达的lncRNAs,采用RT-q PCR、TCGA数据库筛选并验证FAM99A在不同肝癌数据集中的表达。整理肝癌患者的临床资料和随访信息,使用卡方检验分析FAM99A与肝癌患者病理指标的相关性,采用Kaplan-Meier法及Cox回归分析FAM99A在肝癌复发和临床预后中的意义。2.通过定量PCR检测FAM99A在常用肝癌细胞株中的表达;采用慢病毒感染建立FAM99A过表达或敲低的稳定细胞株。采用Transwell、细胞划痕、CCK-8细胞增殖、Annexin-V细胞凋亡实验检测过表达或沉默FAM99A后对肝癌细胞表型的影响;通过尾静脉注射稳定过表达和敲低FAM99A的细胞株构建小鼠肺转移模型,体内评估FAM99A对肝癌细胞侵袭与转移的影响。3.在FAM99A调控肝癌转移的机制研究中,通过Target Scan,mi Randa,RNAhybrid三种生物信息学软件预测FAM99A潜在结合的mi RNA。构建含mi RNA结合位点的荧光素酶（Luciferase,Luc）报告质粒,通过检测Luc活性验证FAM99A结合mi RNA-92a;通过Transwell、细胞划痕和Western blot实验分析FAM99A结合mi R-92a并影响EMT来抑制肝癌细胞迁移和侵袭。4.在调控FAM99A表达的机制研究中,通过缺氧、Co Cl2及缺氧抑制剂2-Meo E-2处理肝癌细胞后,采用定量PCR检测乏氧对FAM99A表达的影响;使用Ch IP-q PCR和荧光素酶报告基因实验探讨HIF-1α结合FAM99A启动子缺氧反应元件（HREs）。通过组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）及其抑制剂TSA处理肝癌细胞后,采用q PCR和Ch IP-q PCR检测缺氧下组蛋白去乙酰化对FAM99A表达的影响。5.对TCGA肝癌转录组数据进行全基因组Cox回归,遴选肝癌预后相关基因。采用NMF一致性聚类对371例TCGA肝癌数据进行聚类分析和验证分子分型,并使用相关系数（Cophenetic Correlation,CC）对聚类效果及稳定性进行评估。对肝癌预后相关基因通过SAM（Significance Analysis of Microarray）和PAM（Prediction Analysis for Microarrays）聚类分析,筛选代表预后分型的特征性基因,并拟合预后预测方程,建立肝癌预后风险评估模型。结果1.分析61例肝癌患者癌与癌旁组织转录组测序数据,发现lncRNA FAM99A在肝癌中的表达显著低于癌旁组织;扩大样本量（n=103）并采用RT-q PCR检测发现,与癌旁组织相比,FAM99A在癌组织中显著下调表达（p<0.0001）,结果与本中心转录组测序数据和TCGA公共数据库分析（n=371,p<0.0001）一致。随后的相关性分析显示FAM99A的表达与患者的年龄、肿瘤包膜完整度、肿瘤分化程度以及复发状况显著相关。通过Kaplan-Meier生存分析观察到肝癌中高表达FAM99A的患者相对低表达患者具有更长的总体生存时间（p=0.006）和无复发生存时间（p=0.020）。Cox回归单因素分析显示,FAM99A（p=0.015）、肿瘤大小（p=0.005）、AFP（p=0.042）、门静脉侵犯（p=0.007）、远处转移（p=0.014）是影响肝癌患者总体预后的重要因素;进一步多因素分析发现FAM99A（p=0.015）和肿瘤大小（p=0.035）是评估肝癌患者总体生存的独立风险因素。2.通过定量PCR检测,发现FAM99A在SK-Hep-1细胞和Hep3B细胞中分别较低和较高表达。表型分析显示高表达FAM99A能显著抑制肝癌细胞SK-Hep-1的迁移与侵袭能力,敲低FAM99A的Hep3B细胞展现出相反的功能。另外,未观察到FAM99A对细胞增殖与凋亡能力的影响。体内小鼠肺转移模型得到与体外一致的结果。Western Blot检测发现过表达FAM99A具有抑制E-cadherin表达、促进N-cadherin表达的作用,敲低FAM99A后观察到相反的结果。3.通过mi Randa,Target Scan和RNAhybrid三种生物信息学软件综合预测,发现FAM99A与mi R-92a之间具有结合潜力。随后的荧光素酶实验证实FAM99A与mi R-92a的结合。通过配对的肝癌临床样本（n=19）检测FAM99A与mi R-92a的表达,显示两者呈显著负相关（p=0.026,r=-0.309）。回补mi R-92a后进行Transwell实验,发现FAM99A通过“海绵”作用废除mi R-92a的促肝癌细胞迁移与侵袭作用,同时Western blot检测发现FAM99A通过下调E-cadherin的表达来逆转mi R-92a诱导的EMT过程。4.上游调控FAM99A表达机制研究中发现,乏氧、Co Cl2处理能显著抑制FAM99A的表达,而HIF-1α的抑制剂2-Meo E-2处理后,能上调FAM99A的表达,提示低氧活化的HIF-1α可能参与调控FAM99A的转录。进一步序列分析发现,FAM99A启动子附近存在3个与HIF-1α潜在结合的反应元件（HREs）。采用RT-q PCR、Ch IP和荧光素酶报告基因实验验证了前面的假设。TCGA肝癌转录组数据证实HIF-1α与FAM99A表达呈负相关。另外,缺氧可引起HDAC1和HDAC3的表达量增高,FAM99A启动子区H3的去乙酰化现象增强;而加入浓度不同的TSA（HDAC抑制剂）培养肝癌细胞后,FAM99A的表达被逆转。TCGA数据再次证实FAM99A表达仅与HDAC1呈显著负相关（与HDAC3相关性不显著）。以上结果表明低氧调控FAM99A表达的第二种方式,即活化并上调HDAC1的表达,引起FAM99A启动子区的去乙酰化,进而抑制FAM99A的表达。体外Transwell实验观察到缺氧能促进肝癌细胞的侵袭和转移,而过表达FAM99A能逆转缺氧对肝癌细胞侵袭转移的促进作用,表明FAM99A参与了低氧对肝癌侵袭转移的调控。最后,在临床样本和小鼠肺转移组织中使用组化检测转移标志蛋白（E-cadherin和Vimentin）和缺氧相关蛋白（HIF-1α、CA9和HDAC1）的表达情况,发现FAM99A高表达的临床肝癌组织和小鼠肺转移组织中E-cadherin表达水平升高,而Vimentin含量降低;高表达FAM99A的组织中HIF-1α、CA9和HDAC1的表达均下调,结果与机制研究结果相一致。5.基于TCGA公共数据库371例肝癌转录组基因表达数据,共筛选出774个肝癌预后相关的基因。使用NMF（Non-negative Matrix Factorization）一致性聚类,我们发现肝癌中存在两种不同预后的分子亚型。随后,使用GSE54236和TCGA两个数据集对两个分子亚型进行差异分析和预后特征比较,发现分子亚型1中的基因在癌组织中的表达水平较癌旁组织高,且亚型1患者具有更短的总生存期;而分子亚型2中的基因在癌中的表达低于癌旁组织,总体生存时间更长。通过SAM和PAM分析,我们筛选出代表肝癌两个亚型的6个特征性基因,采用Logistic回归对6个特征性基因拟合预后方程,用于区分两个分子亚型和评估肝癌患者的预后风险。最后,我们使用本研究中心113例肝癌样本和GSE54236数据集78例肝癌样本对预后模型进行评估效果验证,结果证实预后模型可以很好的评估肝癌患者的预后风险。结论1.在肝癌组织中低表达的lncRNA FAM99A作为评估肝癌患者预后的独立危险因素,与肝癌患者预后不良显著相关,是一种潜在的肝癌标志物。2.体内、外研究表明,FAM99A作为mi R-92a的ce RNA,间接抑制EMT过程进而影响肝癌细胞的迁移与侵袭,但不具有调节肝癌细胞增殖与凋亡的功能。3.缺氧激活的转录因子HIF-1α,通过结合FAM99A启动子区缺氧反应元件HRE3,抑制FAM99A的表达。4.缺氧引起HDAC1的活化,导致FAM99A启动子区组蛋白的去乙酰化增加,使FAM99A的转录被抑制。5.基于TCGA肝癌转录组学数据,发现肝癌中存在两种与肝癌患者预后相关的分子亚型;基于6基因建立的肝癌预后模型,可以有效地预测和评估肝癌患者的预后风险。