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目的:百草枯(Paraquat,简称PQ)是一种广泛使用的除草剂,对人畜均有较强的毒性,且无解毒剂,PQ中毒晚期可导致肺部纤维化直至呼吸衰竭而死亡。根据中毒后肺部上皮细胞转化为间质细胞的生理过程。我们认为缺氧诱导因子(HIF)在PQ中毒导致肺纤维化中起到了重要作用。在PQ中毒导致细胞严重缺氧的条件下,HIF通过结合缺氧反应元件激活下游众多靶基因,从而参与与肺部上皮细胞的血管生成和上皮间质转化(EMT)的环节。HIF也可以直接与细胞信号通路发生反应。本文旨在探索HIF-1α通过Notch1信号通路来调节PQ中毒所致肺部EMT的机制,从而控制纤维化的发生和进展,为PQ中毒的治疗寻找潜在的靶点。方法:1、PQ中毒的小鼠模型建立:以腹腔注射方式染毒,构建PQ染毒后小鼠的肺纤维化模型。方法:A组(生理盐水对照组),B组10mg/kg(单次染毒组),C组:20mg/kg(单次染毒组),D组(10mg/kg隔日一次染毒组,共三次)染毒后观察至第21天麻醉处死小鼠取肺组织,镜下观察病理组织变化,马松染色,Ashcroft评分等方法来评估纤维化程度,提取小鼠肺组织蛋白以Western Blot检测HIF-1α和Notch1的表达情况。2、PQ中毒的细胞模型建立:体外培养的A549细胞系,以终浓度为0,10,30和60μg/ml的PQ进行染毒,染毒观察6天后,MTT法检测细胞活力,Transwell实验观察纤维化细胞的迁移能力,Western Blot和Realtime RT-PCR检测α-SMA和Ecadherin等纤维化指标,并着重检测HIF-1α和Notch1在细胞中毒模型上的蛋白和基因表达情况。3、siRNA干扰验证实验:在上述PQ中毒细胞模型的基础上,以特异性iRNA敲低HIF-1α和Notch1表达,分析α-SMA和E-cadherin的表达及EMT程度的变化,验证HIF-1α-Notch1通路的下调对PQ染毒后EMT的缓解。4、免疫共沉淀(Co-IP)实验:在上述PQ中毒细胞模型的基础上,以Co-IP分析HIF-1α和Notch1蛋白之间的直接相互作用。结果:1、在PQ中毒导致纤维化的小鼠模型中,HIF-1α和Notch1在肺组织中高表达。2、在PQ中毒A549细胞模型中,HIF-1α和Notch1在染毒后细胞中呈高表达。3、在PQ中毒细胞模型中,以特异性iRNAs敲低HIF-1α和Notch1的表达,可降低EMT标记物α-SMA的表达并升高上皮细胞标志物E-cadherin的表达,提示可能对纤维化过程有一定缓解作用。4、在PQ中毒细胞模型中,HIF-1α和Notch1分子之间可能存在直接的相互作用。结论:在小鼠在体和细胞离体水平上模拟了PQ慢性中毒诱导肺EMT致的过程,该过程可激活HIF-1α-Notch1信号通路,表现为HIF-1α和Notch1表达上调,且二者之间存在分子间直接的相互作用。而针对HIF-1α/Notch1通路进行干扰,可缓解PQ中毒所致肺细胞EMT的特征。