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目的:抗生素相关性腹泻的发病率呈逐年递增趋势。已知艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)是引起该腹泻最重要的致病菌之一。近年来,高毒力菌株的流行使艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection,CDI)的病情明显加重,给临床治疗带来严峻的挑战。本研究对山东省内两所三甲医院临床分离的艰难梭菌的实验室检测方法、分子流行病学特征及抗生素耐药性进行了研究,旨在为临床有效防控艰难梭菌感染提供适宜高效的实验室诊断方案和策略。方法:收集2016年3月到2017年5月青岛大学附属医院和淄博市中心医院住院治疗、并疑似抗生素相关性腹泻患者的粪便标本504份,采用酶联免疫法(Enzyme immunoassay,EIA)进行谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GDH)和艰难梭菌毒素A/B(Clostridium difficile toxin A&B,CDAB)检测,同时进行厌氧培养和毒素基因检测,评估GDH和CDAB的EIA检测对CDI诊断的敏感性和特异性。对85株培养阳性的CD菌株进行多位点序列分型、核糖体分型,分析山东地区CD临床分离株的分子流行病学特点,并对72例CDI患者的相关临床症状的严重性进行评分,观察不同型别CD菌株感染者病情严重性之间的差异。采用琼脂稀释法检测CD菌株对6种常用抗菌药物的耐药性,并检测GyrA和GyrB的氨基酸变异,探讨环丙沙星、莫西沙星耐药表型与基因型的关系,分析GyrA和GyrB的氨基酸变异在喹诺酮类抗生素耐药机制中的作用。结果:粪便标本EIA检测和厌氧培养结果显示,GDH-EIA检测阳性115例(22.8%,115/504),CDAB-EIA检测阳性39例(7.7%,39/504),厌氧培养阳性85例(16.9%,85/504)。对培养阳性的CD菌株进一步进行毒素基因检测发现,产毒型CD菌株72例,毒素携带率为84.7%(72/85)。与厌氧培养相比较,GDH-EIA检测具有较高的敏感性(98.8%)和特异性(92.6%),但阳性结果仅表明标本中存在艰难梭菌,与是否是产毒株无关;与产毒培养(厌氧培养+毒素基因检测)相比较,CDAB-EIA检测对CDI诊断的特异性为100.0%,但敏感性仅为54.2%,不推荐单独用于CDI诊断。结合GDH和CDAB的诊断方案对CDI诊断的敏感性仅为54.2%(39/72),进一步加入产毒培养后,可将CDI诊断的敏感性提高到100%。结合GDH、CDAB和产毒培养在CDI诊断中的优劣势,先进行GDH和CDAB的EIA检测,GDH阴性可排除CDI的诊断,CDAB阳性报告CDI,当GDH和CDAB结果不一致时再进行细菌产毒培养,该三步法诊断策略是适合地区性实验室开展的经济、高效的CDI实验室诊断方案。通过对CD菌株进行毒素基因检测和分子分型发现,毒素型为A+B+CDT–的菌株有61例(71.8%,61/85),A–B+CDT–型菌株10例(11.8%,10/85),A+B+CDT+1例(1.2%,1/85),A–B–CDT–13例(15.3%,13/85),主要流行的型别为RT046/ST35(11.8%,10/85)、RT014/ST2(10.6%,9/85)和RT017/ST37(10.6%,9/85)。A+B+CDT–型CD菌株最常见的分子型别是RT046/ST35(16.4%,10/61)和RT014/ST2(14.8%,9/61),A–B+CDT–型菌株最常见的分子型别是RT017/ST37(90.0%,9/10)。本研究在山东省内首次发现了1例RT027/ST1、毒素型为A+B+CDT+的CD菌株,即027型高毒力菌株。首次发现并命名了五个多位点序列分析(Multilocus sequence typing,MLST)的新型别:ST450、ST451、ST452、ST453、ST454。对CDI患者的临床严重性评分结果表明,感染A-B+CDT-型CD菌株患者的疾病严重性(3.50±0.85)高于A+B+CDT-型菌株感染者(2.59±0.93,P<0.05),RT046/ST35型CD菌株感染者的疾病严重性(3.80±0.92)高于RT001/ST3(2.63±0.74)和RT020/ST2(2.57±0.79)型菌株感染者(P<0.05)。CD菌株的体外药物敏感性试验结果显示,85株CD菌株对万古霉素和甲硝唑均具敏感性,对环丙沙星、红霉素和克林霉素呈现不同程度耐药,耐药率分别为97.6%(83/85)、64.7%(55/85)和58.8%(50/85)。产毒型CD菌株对环丙沙星均呈耐药,对红霉素(70.8%,51/72)、克林霉素(65.3%,47/72)和四环素(38.9%,28/72)的耐药率亦高于非产毒菌株(P<0.05)。通过对GyrA和GyrB的氨基酸变异进行分析发现,Thr82→Ile和Ser366→Ala氨基酸替代与CD菌株对莫西沙星的MIC升高有关,耐药表型与基因型相一致,推测GyrA和GyrB氨基酸变异可能是CD菌株对莫西沙星耐药的产生机制。结论:GDH和CDAB联合检测,必要时再辅以产毒培养可准确诊断CDI。RT046/ST35、RT014/ST2和RT017/ST37型CD菌株是部分山东地区常见的流行菌株。RT027型高毒力菌株在山东地区首次被分离报道。CD菌株对环丙沙星、红霉素和克林霉素耐药率较高,万古霉素和甲硝唑仍是治疗CDI的一线药物。