论文部分内容阅读
包含Epichloe属和Neotyphodium属真菌的epichloe内生真菌能够与冷季型和本科植物形成广泛的共生关系,一般不会使宿主表现出典型的病理症状,而且会给宿主带来对干旱、病虫害及动物采食的抗性。这种抗性主要归因于真菌的非核糖体肽合成酶系合成的各种杂环生物碱。前人在epichloe内生真菌中已发现了12个NRPS基因和一个疑似NRPS基因,其中有些和生物碱的合成有关。本研究利用前人的引物,调查NRPS基因在中国发现的禾本科植物内生真菌中的分布,并以Epichloe festucae E2368的全基因组为基础,分析了其中可能存在的NRPS基因。第一,2006年到2009年,从安徽黄山和江苏南京分别采集雀麦属植物和羊茅属植物各163和148株,分别鉴定为雀麦(Bromus japonicus Thunb. ex Murr.)和鼠茅(Featuca myuros L.)。通过检测发现72%的雀麦样品和91.2%鼠茅样品中分别含有epichloe内生真菌,从这些样品中分别获得3个和11个菌株。雀麦分离菌株生长速度58-79mm/10d,分生孢子多而小,呈圆形或椭圆形,4.3±0.1×2.7±0.1μm;鼠茅分离菌株生长速度15-20mm/6w,孢子大而少,呈肾形或椭圆形,5.4-7.8×2.9-4.1μm.通过基于tefA和tubB的系统发育学分析,发现它们都可能由EBY和ETC成员进化而来。我们据此将鼠茅分离菌株鉴定为Neotyphodium sinofestucae Y. Chen, Y. Ji et Z. Wang,将雀麦分离菌株鉴定为新种,并命名为Neotyphodium huibromum Z. Wang et K. Han sp. nov.。第二,利用特异性引物,检测了来自我国雀麦属,翦股颖属,羊茅属,披碱草属,早熟禾属,鹅观草属,短柄草属,拂子茅属等8属9种植物的20个epichloe真菌菌株中NRPS基因片段。NRPS6在所有菌株中都有分布；NRPS2、NRPS5、NRPS8、NRPS9、 CPS1和AC202在除Psh6102外的所有菌株中都有分布；和麦角类生物碱多肽侧链合成有关的lpsB则具有一定的分布,lpsA基因却在所有菌株中都没有检测到；其它NRPS基因的分布则显示出菌株和地域的差异性。以上证实了13个NRPS基因在我国禾本科植物内生真菌中都有分布,但是呈现出一定的宿主和地域差异。第三,本研究利用引物RJ6-F和RJ6-R检测了含菌与不含菌鹅观草中NRPS8的分布情况,发现含菌样品中可以检测到相应片段,而不含菌样品中检测不到。将含菌鹅观草样品扩增片段与纯培养菌株中扩增得到的片段经克隆测序和序列比对后发现两者具有完全的序列相似性。以上说明应用该引物可以通过PCR检测鹅观草植株中内生真菌存在与否。这是一种特异性高、结果准确的检测方法,且将来有望用于epichlo6内生真菌自动化检测法的开发,但其泛用性还有待进一步验证。第四,本研究以E. festucae E2368菌株基因组为研究对象,通过对全基因组建库搜索和仔细的分析,证实E. festucae E2368基因组中含有至少19个可能的NRPS基因簇,远多于先前E. festucae两个菌株中10个以及欧美70个菌株中13个的报道。这19个NRPS基因簇分别被命名为nef1-nefl9.在E. festucae E2368基因组中,已报道的13个NRPS基因中有5个存在缺失和重复现象,这13个已报道的NRPS基因在E. festucae E2368菌株基因组中的实际数目仅为8个。因此,本研究从E. festucae E2368基因组中新发现的NRPS基因数目为11个。通过和NCBI数据库中功能已知的NRPS蛋白比对显示,预测得到的NRPS的相似序列均来自真菌,但仅有9个功能可推测。可能用来合成环孢菌素的NRPS在基因组中有三个拷贝,存在产生相同或相似产物的现象。第五,各个NRPS中含有1-8个不等的腺苷酸化结构域,通过对发现的NRPS基因所有腺苷酸化结构域(A domain)蛋白质序列构建邻接树发现,不同NRPS基因的有些腺苷酸化结构域会聚到同一分枝,而同一NRPS基因的腺苷酸化结构域则会分别分散于不同分枝,反映出它们所催化的反应的底物和产物的复杂性。这证明了简并引物可能存在的局限性,以及腺苷酸化结构域在同一NRPS基因中的差异性。以上结果说明内生真菌中NRPS的多样性远多于预期。本研究以中国禾本科植物中分离到的内生真菌为研究对象,首先发现了一个新种和一个种的新宿主,同时,调查了NRPS基因在20个菌株中的分布和部分NRPS基因的系统发育学特征；基于这些特征建立了一个基于NRPS8基因片段的鹅观草内生真菌的检测方法,最后通过对E. festucae E2368基因组的检索,发现了11个可能新的NRPS基因簇,通过分析,指出了内生真菌中NRPS的多样性远多于预期的倾向,为进一步研究中国内生真菌中的NRPS基因及其产物奠定了基础。