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人们通过基因工程技术发掘了一批拥有一定针对性的抗病基因,这些基因可以作为一个复杂的基因防御体系保护水稻植株免于细菌、真菌、病毒以及线虫病原菌的侵染。抗病基因在植物体内编码的产物可以特异性地识别不相容的病原体,引发一系列级联反应,导致宿主发生抗病反应。一种小分子的植物激素—水杨酸(SA)在植物抗病过程中扮演着重要的作用。病原体应答性的水杨酸生物合成被认为是受到PAD4、EDS5以及SID2控制的。而PAD4、EDS5、SID2的病原诱导表达在拟南芥中会被AtSRT2抑制,说明AtSRT2在调节SA合成方面有重要作用。水稻中含有AtSRT2的同源基因—OsSRT2,它们都属于沉默信息调节因子2(Silent information regulator2,Sir2)蛋白。Sir2自首次在酵母中被克隆出来以来,其同源物在一些哺乳动物中被相继被克隆,然而我们对植物中Sir2家族的作用却知之甚少。 为了探究Sir2类型蛋白在水稻系统获得抗性中所扮演的角色,我们研究了OsSRT2的亚细胞定位情况;转基因植株中的基因表达量及其与抗性诱导相关水杨酸含量的关系;转基因植株对白叶枯病病菌的抗性情况等。具体如下: 1.从水稻日本晴cDNA中克隆出SAR信号途径的关键基因OsSRT2,序列分析显示该其基因 cDNA的全长为938 bp的OsSRT2基因编码的蛋白质分子量Mw=34.56kD,等电点pI=8.76。与NCBI已登录的水稻SRT2基因同源性为99%,蛋白质序列同源性100%,说明SRT2在物种进化过程中核苷酸发生了同义突变,而蛋白质水平的进化较保守。 2.为了发现OsSRT2基因的作用部位,推测OsSRT2作用方式提供依据。通过基因枪,瞬时转化35S-OsSRT2-GFP融合表达质粒到洋葱表皮细胞,在荧光显微镜下检测亚细胞定位情况,结果可见OsSRT2定位于细胞核内。 3.构建了OsSRT2的过量表达载体和RNAi干涉载体,通过农杆菌转化技术导入水稻内,共记获得9株T1代过表达阳性植株,8株T1代干涉阳性植株。对获得的转基因植株T1代体内游离态水杨酸(SA)含量进行HPLC测定,OsSRT2过表达植株体内水杨酸的含量明显低于对照;而OsSRT2RNAi植株体内自由态水杨酸的含量大约是对照的1.5倍。说明OsSRT2参与调节SA在植株体内的积累,抑制植株体内的SA含量,从而间接证明了OsSRT2参与SA介导的抗病信号过程。 4.对转基因植株中目的基因的水杨酸诱导表达模式进行了分析,结果显示,过表达植株中OsSRT2的含量高于野生型两倍多,在SA处理后有一定下降,但依旧维持在较高的水平。而干涉植株的OsSRT2的含量大约为野生型的1/2,在SA处理后也有一定下降,处于一个较低的表达水平。 5.在剑叶期分别对OsSRT2过表达,OsSRT2-RNAi及野生型的日本晴植株进行白叶枯病病原菌接种鉴定,结果显示:OsSRT2-RNAi的抗病能力明显提高,而OsSRT2过表达转基因水稻水稻更易感病。 上述表明克隆的OsSRT2基因通过负调控作用与水稻的抗病性相关。系统获得性抗性(SAR)是植物抗病体系的一种重要的组成部分,而SRT2类基因也是SAR系统中的主要作用基因,因此,成功获得OsSRT2基因并进行相关研究,不仅揭示了OsSRT2的作用方式和在抗病通路中扮演的角色,而且提供对转基因水稻抗虫品种有使用意义的目的基因,具有重要的应用价值。